EPCs聯(lián)合MSCs作為組織工程心臟瓣膜種子細胞實驗研究.pdf

1、目的：獲取理想種子細胞——具有相應功能的自體活性細胞，是目前TEHV研制的重點，尋找一條便捷、有效的獲取種子細胞的方法，并完善內(nèi)皮化，是構(gòu)建TEHV的核心問題。本課題取材骨髓，分離得到內(nèi)皮祖細胞(EPCs)和骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)，體外培養(yǎng)、擴增、分化，種植于去細胞豬主動脈瓣支架材料，進行構(gòu)建TEHV實驗研究，探討EPCs聯(lián)合MSCs構(gòu)建TEHV的可行性和條件，為新型組織工程心臟瓣膜種子細胞的選擇提供實驗基礎。 方法：

2、 1.采用免疫磁珠和貼壁換液兩種方法，分離得到EPCs和MSCs，進行體外培養(yǎng)擴增、分化、鑒定及一般生物學特性研究：①內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，纖維粘連蛋白包被培養(yǎng)皿，以EGF、IGF-1、VEGF等生長因子誘導EPCs分化，采用免疫組化CD31、Ⅷ因子相關(guān)抗原染色、流式細胞儀與電鏡鑒定，以荊豆凝集素吸收試驗(UEA-1)、乙?；兔芏戎鞍?DiI-Ac-LDL)攝取試驗以及合成分泌NO評價內(nèi)皮細胞功能；同時，在EPCs培養(yǎng)中加入他

3、汀類藥物，觀察EPCs增殖和遷移情況。②DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)擴增，以5-Aza誘導MSCs分化，采用α-SMA、Vimentin免疫組化染色鑒定其分化表達，以免疫組化Ⅰ、Ⅲ膠原染色評價其分泌功能。③通過對獲得EPCs細胞數(shù)量和純度的分析，比較免疫磁珠和貼壁換液兩種方法的優(yōu)缺點。 2.采用改變滲透壓和酶消化的方法制備去細胞豬主動脈瓣支架，將分化后的MSCs和EPCs序貫式種植于支架材料，置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，靜態(tài)構(gòu)建TEHV。培養(yǎng)30天

4、后取出，通過石蠟包埋切片HE染色，免疫組織化學染色和電鏡觀察，評價TEHV的組織學結(jié)構(gòu)，考察種子細胞的粘附生長情況。 結(jié)果： 1.從骨髓中可以分離得到EPCs和MSCs。原代培養(yǎng)的MSCs呈多角形或梭形，4-7天后呈集落樣生長，其α-SMA、Vimentin和Ⅰ、Ⅲ膠原免疫組化染色染色呈陽性，提示可以分化為肌纖維細胞；超微結(jié)構(gòu)胞漿內(nèi)含有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及分泌小泡，提示具有旺盛的分泌功能。內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)的EPCs呈短梭形

5、及多角形，12d后呈鋪路石樣生長，表達CD31、Ⅷ因子相關(guān)抗原，UEA-1結(jié)合試驗和DiI-Ac-LDL吸收試驗陽性，超微結(jié)構(gòu)顯示細胞內(nèi)可見Weibel-Palade小體。 2.采用免疫磁珠和貼壁換液兩種方法，均可分離得到較高純度的EPCs和MSCs。免疫磁珠法分離所得EPCs純度更高，為76％，但方法復雜，費用高。人骨髓MSCs有很強貼壁能力，培養(yǎng)開始24小時內(nèi)有90％左右貼壁生長，通過逐次貼壁培養(yǎng)，將幾乎全部成纖維細胞和大部

6、分巨噬細胞去除。以貼壁換液法懸液離心繼續(xù)培養(yǎng)，可獲得EPCs，其純度為29％，此方法簡便、經(jīng)濟、實用。 3.EPCs和MSCs通過體外擴增可達到細胞種植所需數(shù)量。MSCs呈指數(shù)增殖，10ml骨髓液分離得到的MSCs體外培養(yǎng)14d可獲得2×108數(shù)量細胞，足以滿足構(gòu)建TEHV時細胞種植的需要；EPCs細胞含量少，但在內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，纖維粘連蛋白包被培養(yǎng)皿，以及EGF、IGF-1、VEGF等生長因子誘導下，聯(lián)合他汀類藥物進行

7、動員擴增，在體外培養(yǎng)21d可獲得5×107數(shù)量細胞，也能夠滿足構(gòu)建TEHV時細胞種植的需要。 4.采用改變滲透壓和酶消化的方法制備去細胞豬主動脈瓣支架，細胞成分被充分去除，支架材料的力學強度、理化性能、組織相容性好；種子細胞采用序貫式種植(先種植MSCs，后種植EPCs)和間隔36h反復多次接種的方法可增強細胞粘附性并提高種子細胞的接種率。 5.對靜態(tài)構(gòu)建的組織工程瓣葉檢測：誘導后種植的MSCs向成肌纖維細胞分化，所構(gòu)建

8、的TEHV瓣葉間質(zhì)中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯增加，表明種植的MSCs生長良好，并具有分泌膠原的功能。與單純MSCs種植組比較，在聯(lián)合種植組中，其細胞種類更全，EPCs細胞也能增殖，粘附TEHV表面形成內(nèi)皮細胞層，并表達Ⅷ因子相關(guān)抗原，同時，掃描電鏡顯示去細胞支架表面被內(nèi)皮細胞覆蓋，表面光滑。試驗中還將體外構(gòu)建的TEHV瓣葉與天然的豬主動脈瓣腋進行比較，在生物學強度方面沒有統(tǒng)計學差異。以上結(jié)果初步說明，EPCs聯(lián)合MSCs作為TEHV種子細胞

9、所構(gòu)建的組織工程心臟瓣膜在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生物學強度上與正常瓣膜具有相似性，應用此組織工程技術(shù)體外構(gòu)建組織工程心臟瓣膜是可行的。 結(jié)論：本實驗采用免疫磁珠和貼壁換液兩種方法，均可從骨髓中分離得到內(nèi)皮祖細胞(EPCs)和間充質(zhì)干細胞(MSCs)，免疫磁珠法分離所得EPCs純度高、數(shù)量大，方法復雜、費用高；以貼壁換液法懸液離心繼續(xù)培養(yǎng)，獲得EPCs純度低、數(shù)量小，方法簡便、經(jīng)濟、實用。骨髓中分離培養(yǎng)EPCs，其形態(tài)與細胞表面標記等與文獻

10、報道基本符合，通過CD31、Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化，UEA-1結(jié)合試驗和DiI-Ac-LDL吸收試驗以及透射電鏡等鑒定，具有分化為成熟內(nèi)皮細胞的能力。同時，分離得到MSCs，通過α-SMA、Vimentin以及Ⅰ、Ⅲ膠原免疫組化等鑒定，具有分化為成熟肌纖維細胞的能力。骨髓來源MSCs和EPCs具有分化成間質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞能力，通過體外生長因子刺激和動員擴增可達到細胞種植所需數(shù)量，同時具有許多優(yōu)點：骨髓取材方便，體外培養(yǎng)擴增后可以獲得大量