生物芯片和納米中藥對(duì)肝膽腫瘤早期診治的研究.pdf

1、第一部分生物芯片早期診斷肝膽腫瘤的探討
　　PartⅠMeDIP芯片分析和建立膽管癌差異甲基化譜
　　目的:利用全基因組啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化位點(diǎn)檢測(cè)芯片技術(shù),分析人膽管癌細(xì)胞株與人正常膽管上皮細(xì)胞株間的基因甲基化差異,建立膽管癌基因差異甲基化譜,為尋找特異性膽管癌早期診斷標(biāo)志物奠定。
　　方法:采用NimbleGenHG18CpGPromoter芯片(Roche,Germany)分別檢測(cè)人膽管癌細(xì)胞株TFK-1和人正

2、常膽管上皮細(xì)胞株BEC全基因組啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化位點(diǎn),并分析比較兩細(xì)胞株間的差異甲基化位點(diǎn)。并應(yīng)用MolecularAnnotationSystem(MAS)軟件分析差異甲基化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因的功能。采用亞硫酸氫鹽測(cè)序法(BSP)檢測(cè)HOX基因甲基化水平。采用熒光定量PCR和western-blot法檢測(cè)目的基因在細(xì)胞水平的表達(dá)情況。免疫組化檢測(cè)目的基因在膽管癌和癌旁組織中的表達(dá)差異。甲基化PCR(MSP)檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑干預(yù)前后

3、,目的基因甲基化的變化情況。
　　結(jié)果:1.MeDIP芯片結(jié)果顯示:相比于BEC細(xì)胞株TFK-1細(xì)胞株中有2103個(gè)CpG島表現(xiàn)為差異性高甲基化;
　　2.在所有差異性高甲基化CpG島中有97個(gè)基因?qū)儆贖OX家族基因,這些基因涉及細(xì)胞分化、周期改變、粘附、侵襲與轉(zhuǎn)移以及血管生成等多個(gè)腫瘤發(fā)生機(jī)制;
　　3.SignalMap軟件分析這97個(gè)HOX家族基因,發(fā)現(xiàn)甲基化率最高的前15位基因是HOXA5、HOXA2、HOXA

4、11、HOXB4和HOXD13。BSP證實(shí)其各自的甲基化率為:HOXA5(95.38％)、HOXA2(94.29%)、HOXA11(91.67%)、HOXB4(90.56%)和HOXD13(94.38%);
　　4.PCR和Western-blotting結(jié)果顯示:在肝癌、膽管癌、胰腺癌和大腸癌等消化道腫瘤細(xì)胞株中,膽管癌細(xì)胞株TFK-1中HOXA5表達(dá)量最低。免疫組化顯示:相比于癌旁和正常膽管組織而言,膽管癌中HOXA5表達(dá)量明

5、顯降低。MSP證實(shí):在甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑干預(yù)后,HOXA5在TFK-1中甲基化程度明顯降低。
　　結(jié)論:1.MeDIP芯片是篩選膽管癌早期診斷標(biāo)志物的有效方法之一;
　　2.DNA甲基化可能是HOXA5在膽管癌中表達(dá)降低的重要原因,且HOXA5高甲基化可作為膽道腫瘤的早期診斷標(biāo)志物之一。
　　PartⅡ無(wú)透鏡顯微鏡聯(lián)合細(xì)胞診斷芯片集成系統(tǒng)的構(gòu)建
　　目的:微流控芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip)技術(shù)越來(lái)越多地

6、用于細(xì)胞毒性檢測(cè)和藥物測(cè)試。該技術(shù)主要利用蝕刻技術(shù)到以各種材料制作的芯片上的通道和孔洞構(gòu)成的“網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建微型實(shí)驗(yàn)室。實(shí)際應(yīng)用時(shí),壓力以精細(xì)控制的方式推動(dòng)鈉升的體積流過(guò)通道,從而實(shí)現(xiàn)在單個(gè)集成的系統(tǒng)上進(jìn)行樣品處理、混合、稀釋、電泳、定點(diǎn)追蹤以及色譜分析、染色和檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)的目的是利用德國(guó)IBMT研究所先進(jìn)的芯片實(shí)驗(yàn)室,構(gòu)建一種方便攜帶使用、成本低廉、快速分析、樣本和試劑消耗少的細(xì)胞診斷芯片。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)利用接觸式光學(xué)平板印刷技

7、術(shù)的原理構(gòu)建了一種無(wú)透鏡熒光顯微鏡/光學(xué)顯微鏡聯(lián)合細(xì)胞芯片集成系統(tǒng)。生物樣本被放置在一個(gè)包含有一個(gè)1.5μl漏斗狀的腔及底部為1μm厚的硅氮化合物的MEMS芯片內(nèi)。再將芯片裝載在一個(gè)5兆彩色CMOS成像元件陣列上,最后在兩者間覆蓋一個(gè)光濾片。利用此系統(tǒng)培養(yǎng)鼠源性纖維細(xì)胞L929和人膽管癌細(xì)胞TFK-1。同時(shí),分別用ErythrosineB和FITC進(jìn)行細(xì)胞染色處理后,再比較此系統(tǒng)與傳統(tǒng)熒光顯微鏡的成像效果。
　　結(jié)果:1.該系統(tǒng)監(jiān)

8、測(cè)L929細(xì)胞及TFK-1細(xì)胞影像的對(duì)比度和清晰度與4x物鏡下的影像基本一致;
　　2.定點(diǎn)追蹤觀察單個(gè)或少量細(xì)胞形態(tài)變化,效果良好;
　　3.L929經(jīng)紅染或綠色熒光染色后,該系統(tǒng)顯示細(xì)胞形態(tài)清晰。
　　結(jié)論:該組件可用于動(dòng)態(tài)定點(diǎn)監(jiān)測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞的熒光圖像,為后期診斷芯片的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供重要的參考數(shù)據(jù)。
　　第二部分雷公藤內(nèi)酯醇新型固體納米粒治療肝膽腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究
　　PartⅠ地西他濱和丙戊酸鈉單

9、用對(duì)人膽管癌生長(zhǎng)抑制作用研究
　　目的:探討地西他濱(DAC)和丙戊酸鈉(VPA)單用對(duì)人膽管癌細(xì)胞株TFK-1、QBC939、HUCCT、CCLP1細(xì)胞增殖的影響,并探討其可能的機(jī)制。
　　方法:1.采用CCK8法檢測(cè)DAC、VPA單獨(dú)使用時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率;
　　2.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DAC、VPA單獨(dú)使用后細(xì)胞周期的變化;
　　3.經(jīng)Hochst33342/PI染色,光鏡下觀察經(jīng)DAC、VPA單獨(dú)使用后細(xì)

10、胞形態(tài)的變化,同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)處理后細(xì)胞凋亡情況;
　　4.光鏡下觀察經(jīng)DAC、VPA單獨(dú)使用細(xì)胞120h后,細(xì)胞分化的情況;
　　5.構(gòu)建GFP-LC3質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細(xì)胞,再加入DAC、VPA單獨(dú)使用處理72小時(shí),熒光顯微鏡觀察細(xì)胞自噬情況;
　　6.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用裸鼠TFK-1細(xì)胞皮下種植瘤模型,觀察DAC、VPA單獨(dú)使用對(duì)瘤體生長(zhǎng)及生存率的影響。
　　結(jié)果:1.DAC、VPA單獨(dú)使用對(duì)人膽管癌細(xì)胞的增殖抑制

11、作用呈時(shí)間和劑量依賴性;
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示,隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng),膽管癌細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的G2/M或G0/G1期阻滯;
　　3.經(jīng)DAC、VPA單獨(dú)使用后,光鏡下可見(jiàn)凋亡的細(xì)胞呈明顯的胞體固縮、核固縮、核碎裂及凋亡小體形成。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明:細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性;
　　4.光鏡下觀察到DAC、VPA單獨(dú)使用120h后,細(xì)胞形態(tài)呈樹(shù)突狀突起;
　　5.熒光顯微鏡下觀察到DAC、VPA單獨(dú)使用后

12、,細(xì)胞有明顯的自噬現(xiàn)象;
　　6.體內(nèi)試驗(yàn)證明:當(dāng)應(yīng)用DAC或VPA后,總給藥時(shí)間為2周時(shí),其對(duì)裸鼠TFK-1細(xì)胞皮下移植瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。而且,治療組的裸鼠生存期較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)。
　　結(jié)論:體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證實(shí),DAC或VPA對(duì)膽管癌細(xì)胞均具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用。
　　PartⅡ雷公藤內(nèi)酯醇新型固體納米粒對(duì)肝癌生長(zhǎng)抑制的研究
　　目的:1.觀察雷公藤內(nèi)酯醇新型固體納米粒(TP-SLN)經(jīng)尾靜脈注射

13、給藥對(duì)SPF級(jí)BALB/C小鼠的急性毒性研究;
　　2.觀察TP-SLN對(duì)肝癌細(xì)胞株H22體外和荷瘤體內(nèi)的抗腫瘤作用研究
　　方法:1.雷公藤內(nèi)酯醇(TP)和TP-SLN分別作用于H22細(xì)胞24h、48h和72h后,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的存活率;
　　2.SPF級(jí)BALB/c小鼠50只(雌雄各半),按照0.65mg/kg,0.773mg/kg,0.919mg/kg,1.189mg/kg,1.300mg/kg單次尾靜脈注

14、射給予TP-SLN,共5個(gè)劑量組。觀察小鼠單次給藥的癥狀體征,統(tǒng)計(jì)死亡率、體重等相應(yīng)指標(biāo)的變化;
　　3.建立H22細(xì)胞BALB/c小鼠皮下移植瘤模型,分為生理鹽水空白對(duì)照組,空白固體脂質(zhì)納米粒組,雷公藤內(nèi)酯醇(TP)組,TP-SLN組,順鉑陽(yáng)性對(duì)照組,隔日尾靜脈給藥后觀察記錄腫瘤的體積、體重、一般生長(zhǎng)活動(dòng)狀況。12天后處死所有小鼠,剝離腫瘤組織進(jìn)行稱重。
　　結(jié)果:1.體外實(shí)驗(yàn)中,TP-SLN對(duì)H22細(xì)胞生長(zhǎng)抑制呈時(shí)間和劑

15、量依賴性,作用明顯且強(qiáng)于TP;
　　2.TP-SLN對(duì)于SPF級(jí)BALB/c小鼠尾靜脈注射途徑而言,其LD50值為0.891mg/kg,95%的可置信區(qū)間是0.814mg/kg—0.971mg/kg。并且在該劑距范圍內(nèi),TP-PM對(duì)于BALB/c小鼠而言,死亡率呈現(xiàn)良好劑量效應(yīng)關(guān)系;觀察發(fā)現(xiàn):TP-PM對(duì)于SPF級(jí)BALB/c小鼠而言,在注射后的4hrs內(nèi)小鼠均未出現(xiàn)死亡,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),部分小鼠癥狀逐漸加重抖動(dòng),共濟(jì)失調(diào),進(jìn)而活

16、動(dòng)減少,活動(dòng)抑制直至死亡;BALB/c小鼠死亡時(shí)間集中在24-48hrs,96hrs后絕大部分存活動(dòng)物恢復(fù)正常的運(yùn)動(dòng)、呼吸等,體重上升。
　　3.與生理鹽水空白對(duì)照組比較,TP、TP-SLN及順鉑均引起腫瘤體積下降和體重減輕。抑瘤率分別為22.4%、49.2%、51.5%。TP、TP-SLN與生理鹽水空白對(duì)照組相比,小鼠的生活狀態(tài)(體重、反應(yīng)能力等)均有一定的改善。順鉑組生活狀態(tài)無(wú)明顯改善。
　　結(jié)論:與TP相比,TP-SL

17、N體內(nèi)、外對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制增強(qiáng)且穩(wěn)定、持久,副作用減弱。
　　PartⅢ地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉增強(qiáng)TP-SLN對(duì)人膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的初步研究
　　目的:探討DAC聯(lián)合VPA能否增強(qiáng)TP-SLN對(duì)人膽管癌細(xì)胞殺傷作用。
　　方法:DAC聯(lián)合VPA預(yù)處理TFK-1細(xì)胞3天后,再加入TP-SLN處理24h、48h和72h,采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。
　　結(jié)果:與未預(yù)處理組相比,地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉預(yù)處理后,T

18、P-SLN對(duì)人膽管癌細(xì)胞增值抑制作用明顯增強(qiáng)
　　結(jié)論:地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉預(yù)處理增強(qiáng)TP-SLN對(duì)人膽管癌細(xì)胞增值抑制效應(yīng)。
　　第三部分應(yīng)用無(wú)透鏡顯微鏡聯(lián)合細(xì)胞診斷芯片集成系統(tǒng)初探納米中藥對(duì)膽管癌細(xì)胞作用機(jī)制
　　目的:應(yīng)用無(wú)透鏡顯微鏡聯(lián)合細(xì)胞診斷芯片集成系統(tǒng)觀察納米中藥與膽管癌細(xì)胞間相互作用
　　方法:應(yīng)用無(wú)透鏡顯微鏡聯(lián)合細(xì)胞診斷芯片集成系統(tǒng)培養(yǎng)TFK-1細(xì)胞72小時(shí)后,培養(yǎng)基中加入TP-SLN,采集處理2