生物催化制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯.pdf

1、近年來，隨著對不同光學異構體藥理作用研究的進展及對消旋藥物申報和使用的限制，手性藥物的研究和開發(fā)已經(jīng)成為國際新藥研究的熱點。利用生物催化技術來合成手性藥物及其中間體，其反應條件溫和，光學純度高，副反應少，收率相對較高，環(huán)境污染較少，因此受到越來越多的關注。本文對整細胞生物催化不對稱還原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯((R)-HPBE)進行了研究。主要內容如下:
　　 ⑴建立了2-氧代

2、-4-苯基丁酸乙酯和2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的氣相色譜分析方法。在水相體系中對本實驗室保藏的63株微生物菌株進行了篩選，得到了一株能高效催化此還原反應的克魯斯假絲酵母Candida krusei SW2026，該菌對產物立體選擇性高，效果穩(wěn)定，并表現(xiàn)出對底物具有一定的耐受能力。
　　 ⑵確定了克魯斯假絲酵母Candida krusei SW2026的羰基還原酶酶活定義及測定方法，并在搖瓶中對其發(fā)酵產酶條件進行了優(yōu)化，確定了最適

3、發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:4.5%葡萄糖，3%蛋白胨，1.5%牛肉膏，0.05%oMn2+；適宜的產酶發(fā)酵條件為初始pH6.0，培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉速180 r/min，發(fā)酵周期48 h。
　　 ⑶研究了克魯斯假絲酵母Candida krusei SW2026催化不對稱還原OPBE生成(R)-HPBE的反應條件，確定了該反應的最適反應溫度為30℃，反應體系最適pH為6，6。考察了輔底物的影響，確定了最適輔底物為葡萄糖。最適菌體濃度為1

4、.5g/10 mL。同時研究了底物濃度對轉化反應的影響，證明了底物對細胞的抑制作用。各添加劑對反應沒有明顯促進作用。通過流加底物的方式可以部分減弱底物的抑制作用并提高轉化的產率。在優(yōu)化條件下反應14 h，ee值和產率分別為97.55%和81.24%。初步嘗試了產物提取，將粗產物通過硅膠柱層析進行分離提純，最后對產物進行核磁共振鑒定為(R)-HPBE。
　　 ⑷考察了非水相體系中克魯斯假絲酵母Candida krusei SW20

5、26催化還原反應的情況。在水/有機溶劑兩相體系中，篩選得到非水相反應介質為鄰苯二甲酸二丁酯，并確定了其與水相的相體積比為1:1左右，pH6，6，溫度30℃，菌體濃度1.25g/10 mL時有利于催化反應的進行。在20 g/L底物濃度下，利用水/鄰苯二甲酸二丁酯兩相體系作為催化介質，ee值，產率以及產物濃度分別可達到97.4%，82.0%和16.6 g/L。而該兩相體系存在產物提取問題。在水/離子液體兩相體系中，以[Bmim]PF6作為離