紅曲霉T-DNA突變體庫(kù)的構(gòu)建、生物學(xué)特性分析及吉霉素合成基因的克隆.pdf

1、紅曲霉（Monascus）能分泌產(chǎn)生紅曲色素（Monascus pigment）、莫吶可琳類(lèi)物質(zhì)(Monacolins)、γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA）、麥角固醇、異黃酮、不飽和脂肪酸和豐富的水解酶類(lèi)等多種有益生物活性物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。目前對(duì)紅曲霉分子生物學(xué)方面的研究比較少。
　　本課題實(shí)驗(yàn)材料為一株從紅曲米中篩選到的紫色紅曲霉（Monascus purpureus）菌株Mp-41

2、，根據(jù)優(yōu)化后的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)化體系，建立了紫色紅曲霉轉(zhuǎn)化庫(kù)，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化子的生物學(xué)特性進(jìn)行分析篩選到一批變異較大的轉(zhuǎn)化子，并對(duì)其主要代謝產(chǎn)物-紅曲色素和桔霉素進(jìn)行初步研究。然后采用基因組PCR分析方法，從它們的基因組中分別擴(kuò)增到兩條pksCT基因啟動(dòng)子區(qū)部分序列和終止子區(qū)部分序列片段。主要的研究結(jié)果為:
　　1、構(gòu)建根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菌株Mp-41的突變體庫(kù)對(duì)影響轉(zhuǎn)化的各因素進(jìn)行優(yōu)化，這些因素包括:菌株Mp-41的培養(yǎng)基種類(lèi)、

3、培養(yǎng)的時(shí)間以及孢子液的濃度;根癌農(nóng)桿菌的濃度;根癌農(nóng)桿菌與菌株Mp-41共培養(yǎng)時(shí)所用膜的類(lèi)型、溫度及共培養(yǎng)的時(shí)間;誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮(AS)的濃度。優(yōu)化后所建立的高效轉(zhuǎn)化體系為:Mp-41菌株在葡萄糖乙醇培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)，20 d后收集制備濃度為104個(gè)孢子/mL的分生孢子懸浮液，誘導(dǎo)劑AS的濃度為100μmol/L，根癌農(nóng)桿菌的濃度為OD600=0.7，根癌農(nóng)桿菌與菌株Mp-41在硝酸纖維素膜(NC膜)上共培養(yǎng)溫度為25℃，最佳共培養(yǎng)

4、時(shí)間為3d。根據(jù)此優(yōu)化后的體系建立了含有1000多株轉(zhuǎn)化子的突變體庫(kù)。
　　2、轉(zhuǎn)化子的潮霉素抗性PCR鑒定以及遺傳穩(wěn)定分析在葡萄糖乙醇培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)突變庫(kù)中的1000多株轉(zhuǎn)化子，然后隨機(jī)挑選60株轉(zhuǎn)化子在不含潮霉素B的葡萄糖乙醇培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d，連續(xù)6代傳代培養(yǎng)后，再在含200μg/mL潮霉素B的葡萄糖乙醇培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，并將菌株Mp-41同時(shí)培養(yǎng)以作對(duì)照所用，觀(guān)察記錄轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)情況，然后計(jì)算轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性。提取轉(zhuǎn)化子的

5、DNA進(jìn)行潮霉素抗性鑒定。結(jié)果表明，所選轉(zhuǎn)化子在遺傳上基本穩(wěn)定，并且T-DNA片段均已經(jīng)整合入紫色紅曲霉轉(zhuǎn)化子菌株中。
　　3、轉(zhuǎn)化子菌株生物學(xué)特性觀(guān)察比較將1000多株紫色紅曲霉轉(zhuǎn)化子菌株接種到葡萄糖乙醇培養(yǎng)基、MEA培養(yǎng)基和CYA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)7d，同時(shí)接種原始菌株Mp-41作為對(duì)照，觀(guān)察菌落表觀(guān)形態(tài)及顯微形態(tài)。結(jié)果表明，與原始菌株Mp-41相比，大部分轉(zhuǎn)化子沒(méi)多大變化，但是少數(shù)轉(zhuǎn)化子在表觀(guān)形態(tài)以及顯微形態(tài)方面發(fā)生了較大

6、變異。
　　4、轉(zhuǎn)化子菌株發(fā)酵產(chǎn)物桔霉素含量變化分析以及色價(jià)的檢測(cè)從形態(tài)變異較大的轉(zhuǎn)化子菌株中隨機(jī)篩選33株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)7d，采用紫外-可見(jiàn)光掃描方法以及薄層層析等方法測(cè)定了轉(zhuǎn)化子的色價(jià)并分析了轉(zhuǎn)化子中桔霉素含量，結(jié)果顯示，與原始菌株相比，轉(zhuǎn)化子菌株的色價(jià)以及桔霉素的含量發(fā)生了不同程度的變化。分析轉(zhuǎn)化子產(chǎn)色素能力發(fā)現(xiàn)，所選轉(zhuǎn)化子菌株中有17株轉(zhuǎn)化子菌株在505nm處的色價(jià)升高，其中轉(zhuǎn)化子Mp-41-155液態(tài)發(fā)酵

7、后色價(jià)達(dá)115.98 U/mL，是Mp-41色價(jià)66.37 U/mL的1.75倍，固態(tài)發(fā)酵后色價(jià)高達(dá)2628.71 U/g，是原始菌株Mp-41色價(jià)1664.74 U/g的1.58倍;剩下其余15株轉(zhuǎn)化子菌株的色價(jià)降低，其中轉(zhuǎn)化子Mp-41-62液態(tài)發(fā)酵后測(cè)得的色價(jià)只有2.71 U/mL，僅為原始菌株Mp-41的0.04倍，固態(tài)發(fā)酵后色價(jià)為556.51U/g，而原始菌株Mp-41色價(jià)為1664.74 U/g。此外，部分轉(zhuǎn)化子在波長(zhǎng)300

8、-600nm處的吸收峰也發(fā)生了程度不同的變化，原始菌株Mp-41有兩個(gè)吸收峰，大部分轉(zhuǎn)化子如Mp-41-81、Mp-41-83、Mp-41-84、Mp-41-85、Mp-41-88、Mp-41-89、Mp-41-90、Mp-41-91、Mp-41-92、 Mp-41-150、Mp-41-151、Mp-41-152、Mp-41-153、Mp-41-155、Mp-41-156、Mp-41-157、Mp-41-160、Mp-41-161、Mp

9、-41-162、Mp-41-163、Mp-41-164、Mp-41-165、Mp-41-169均有三個(gè)明顯的吸收峰，Mp-41-62和Mp-41-86均只有390-400nm左右的一個(gè)吸收峰，其余轉(zhuǎn)化子菌株有兩個(gè)吸收峰。分析各轉(zhuǎn)化子桔霉素產(chǎn)能發(fā)現(xiàn)，有7株轉(zhuǎn)化子的桔霉素含量明顯降低，而且Mp-41-62和Mp-41-86兩株菌株中幾乎檢測(cè)不出桔霉素，估計(jì)是因?yàn)檫@兩株轉(zhuǎn)化子中桔霉素含量低于TLC方法能夠檢測(cè)的最低值0.2μg/g。
　

10、　5、轉(zhuǎn)化子中生物合成桔霉素基因—pksCT基因的保守性分析研究發(fā)現(xiàn)，紅曲霉的色素的合成與桔霉素代謝調(diào)控開(kāi)始于同一個(gè)生物合成途徑，pksCT基因是與紅曲霉桔霉素合成相關(guān)的基因，實(shí)驗(yàn)選擇了32株轉(zhuǎn)化子菌株，運(yùn)用PCR方法，從它們的基因組中擴(kuò)增得到啟動(dòng)子區(qū)部分序列和終止子區(qū)部分序列片段的兩條pksCT基因，大小分別為659 bp和591 bp。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，再通過(guò)NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果表明，擴(kuò)增到的序列之間具有高度的同源性，而