PRGD-FDLLA-β-TCP-NGF復合材料及基因修飾干細胞誘導神經(jīng)修復的研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)的修復尤其是中樞神經(jīng)的修復,一直是研究的難點和熱點。本研究分別從周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)修復著手,探討合適的誘導修復神經(jīng)損傷的生物材料和修復手段,為最終應用于臨床提供依據(jù)。
　　 本論文按仿生原理設計合成的新型誘導神經(jīng)修復材料RGD多肽接枝聚(乳酸-羥基乙酸-L-賴氨酸)／聚乳酸／β-磷酸三鈣／神經(jīng)生長因子(PRGD／PDLLA／β-TCP／NGF,簡稱PRTN),并對其進行了成分和性能表征。對PRTN復合材料進行體外評價:通

2、過測量PRTN體外12周的質(zhì)量損耗和降解液的pH值,確定材料具有很好的降解性；通過酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測PRTN復合材料中神經(jīng)生長因子(NGF)的釋放,表明隨著材料的降解,NGF逐步釋放,第30天仍可檢測到,與PC12細胞作用表明第30天釋放的NGF仍具有活性。將PRTN與原代提取的雪旺細胞復合培養(yǎng),以傳統(tǒng)材料外消旋聚乳酸(PDLLA)作對照,通過四唑鹽(MTT)比色法測試細胞的生長、增殖情況,并用掃描電鏡觀察PRTN表面細胞生長

3、的形態(tài),結(jié)果表明雪旺細胞在PRTN表面的生長、增殖情況優(yōu)于PDLLA,具有良好的細胞相容性。
　　 將PRTN復合材料制備成神經(jīng)導管,移植入10mm神經(jīng)缺損的大鼠,分別于術(shù)后3、6個月觀測受損神經(jīng)的修復效果。大體觀察,術(shù)后3個月時大鼠活動情況得到恢復,術(shù)側(cè)肢體能直立,6個月時活動自如；電生理檢測神經(jīng)傳導速度得到3個月PRTN傳導速度大于對照PDLLA組,6個月時與自體神經(jīng)移植組相當；3個月取材可見再生神經(jīng)已經(jīng)成功橋接遠近斷端,6

4、個月神經(jīng)變粗；取再生的中段神經(jīng)HE染色觀察材料逐步降解,再生神經(jīng)直徑變粗,血管分布更豐富；亞甲藍染色觀察再生神經(jīng)髓鞘厚度3個月時PRTN組優(yōu)于PDLLA組,6個月時髓鞘變厚,大小及分布更均勻,接近自體神經(jīng)移植組；通過透射電鏡觀察再生神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu),圖像分析數(shù)據(jù)顯示3個月時PPRTN材料組髓鞘板層結(jié)構(gòu)和分布與自體移植組相當,6個月時板層結(jié)構(gòu)更加致密和成熟,與正常神經(jīng)接近。
　　 經(jīng)體內(nèi)移植修復神經(jīng)缺損,在三頭肌濕重恢復率、神經(jīng)傳導

5、速度、髓鞘厚度等一系列指標上均優(yōu)于PDLLA,術(shù)后6個月修復效果與自體神經(jīng)移植組無顯著性差異,髓鞘板層結(jié)構(gòu)與正常神經(jīng)接近。
　　 為了進一步探討PRTN復合材料的應用和對干細胞的誘導分化的影響,提取了人骨髓間充質(zhì)干細胞(humanbonemarrowmesenchymalstemcells,hBMMSC),分析了hBMMSC在材料表面生長、增殖情況和周期變化。并將hBMMSC與材料作用前后進行干細胞克隆形成分析和成脂、成神經(jīng)誘導

6、分析。結(jié)果表明hBMMSC在PRTN復合材料表面生長增殖情況良好,材料對hBMMSC細胞周期無影響。PRTN復合材料能獲得干細胞的數(shù)量較對照組多,且能誘導hBMMSC向脂肪細胞分化減少,向神經(jīng)細胞方向分化增加。
　　 在中樞神經(jīng)研究方面,通過體外構(gòu)建慢病毒載體,將BMMSC向神經(jīng)樣細胞(Neuro-likecell,NLs)誘導分化并經(jīng)GDNF基因修飾,通過熒光顯微鏡采像計數(shù),NLs-BMMSC基因轉(zhuǎn)染率高達78％,ELISA實

7、驗表明GDNF過表達。GDNF轉(zhuǎn)染的NLs-BMMSCs經(jīng)尾靜脈注射移植入骨髓清空的小鼠,4周之后經(jīng)MPTP腹腔注射構(gòu)建帕金森病模型。經(jīng)GDNF轉(zhuǎn)染的NLs-BMMSCs移植后,治療組的帕金森老鼠在行為上較對照組有所改善,取食實驗較對照組多；小鼠中腦黑質(zhì)取材并行免疫組化染色,分析表明GDNF治療組PD小鼠TH陽性細胞數(shù)量較對照組多,經(jīng)移植的細胞更多地遷入并集中于受損神經(jīng)細胞所在部位。初步試驗表明經(jīng)骨髓移植的NLs-BMMSCs具有向PD