來源于極端嗜熱細菌的Ⅱ型抗草甘膦EPSPS的性質及高效表達.pdf

1、上 海 海 洋 大 學碩 士 學 位 論 文題 目 ： 目 ： 來源于極端嗜熱細菌的Ⅱ型抗草甘膦 EPSPS的性質及高效表達英文題目： 英文題目： Characterization and high expression of class II5-enopyruvylshikimate-3-phosphate synthasewith tolerance to glyphosate form Thermusthermophilus專 業(yè)

2、： 業(yè)： 生物學研究方向： 研究方向： 生物化學與分子生物學姓 名： 名： 孫百慧指導教師： 指導教師： 姚泉洪二 O 一六年六月五日學 校 代 碼 ： 10264研究生學號： M130209532上海海洋大學碩士學位論文2中文摘要 中文摘要草甘膦是非常優(yōu)秀的除草劑， 除草劑草甘膦屬于典型的有機磷類除草劑。 草甘膦在作用過程中，其作用靶標是植物體內的 5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPs） 。草甘膦對植物的作用機理主要是與磷

3、酸烯醇式丙酮酸（PEP）之間產(chǎn)生的競爭性抑制作用，從而阻截了植物體內 EPSP 合成酶的活性，致使植物體內莽草酸的大量累積和貯存，阻止了植物體內芳香族氨基酸這類化合物的合成，同樣也抑制了植物的生長和發(fā)育， 最終將植物殺死。 草甘膦以其獨特有效的作用方式，至今為止仍為全世界銷量最高的除草劑品種。草甘膦大規(guī)模大面積的使用在很大程度上促進了抗草甘膦農作物培育種植的興起。借助于基因工程的方法，能使草甘膦工業(yè)化生產(chǎn)得到更好的發(fā)展。決定具有草甘膦抗

4、性的特殊基因，是由 aroA 基因決定的，這個基因可以編碼合成EPSP 合成酶。 到目前為止， 最為常用有效的方法是從農桿菌 （Agrcbacterium spp.）菌系 CP4 中，研究并克隆得到對草甘膦具有抗性的基因，再把得到的目的基因導入到植物體內，就可以得到具有對草甘膦有抗性的作物（抗草甘膦作物） ?，F(xiàn)階段的農業(yè)市場中出現(xiàn)的抗草甘膦作物，絕大部分都是轉有 CP4 基因的抗草甘膦作物。本文首先根據(jù) Thermus thermoph

5、ilus 的 EPSP 合成酶的蛋白序列和合理的設計，設計出新的 EPSP 合成酶基因的核苷酸序列。然后再根據(jù)該核苷酸序列繼續(xù)設計出一系列引物， 從而來合成我們所需要的目的基因。 利用 PTDS (兩步 PCR )合成法可以快速高效地將來源于極端嗜熱細菌 （Thermus thermophilus） 的野生型TTAROA 基因通過合成，成為能夠在異源的大腸桿菌中高效表達的新型 EPSP 合成酶基因 TtaroAS。將合成好的基因通過大腸

6、桿菌完成克隆并進行測序鑒定，結果顯示出設計的基因序列與野生型的基因序列完全達成一致。 新的 EPSP 合成酶基因與野生型基因之間的核苷酸序列比對結果顯示出 74.9 %的相似性。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶[5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase(EPSPS)]是莽草酸途徑中重要的合成酶， 這種酶可以調節(jié)在植物體內和微生物中芳香族化合物的合成。 通過進化分析證實該酶屬于Ⅱ型 EPSP