同源重組vgb基因提升果膠酶枯草桿菌工程菌亞麻脫膠能力.pdf

1、在眾多的紡織纖維中，麻類纖維是極具發(fā)展?jié)摿Φ木G色環(huán)保纖維。然而，作為麻類纖維原料的原麻中含有大量的膠質，如果膠、半纖維素、木質素和蠟脂質等，不能直接用于紡紗工藝，必須經(jīng)脫膠處理才能進行后續(xù)加工。麻脫膠是一個復雜的提取麻纖維的過程。從環(huán)境保護角度考慮，生物脫膠被認為是能夠取代耗能大、效率低、污染嚴重的傳統(tǒng)脫膠工藝的極有發(fā)展前途的一種方法。用基因工程菌產(chǎn)生的堿性果膠酶處理代替堿對麻織物進行煮練加工和整理工藝，以去除初生胞壁中的果膠物質，在比

2、較緩和的pH值和溫度條件下使織物手感柔軟，強度高，而且還能避免因微生物處理造成的纖維素的降解。
　　近年來，人們對透明顫菌 VHb基因(vgb)已進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)該基因的表達能夠改善宿主細胞的呼吸強度、降低細胞臨界氧濃度、促進細胞高密度培養(yǎng)，可促進宿主細胞生長，提高目的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量以及蛋白的合成，延長細胞的壽命。
　　為了提高Bacillus subtilisA5菌株產(chǎn)果膠酶能力，本研究通過同源重組方法將vgb基因整合到

3、Bacillus subtilisA5染色體上，得到能夠正確表達VHb的工程菌株Bacillus subtilisA5-vgb(+)，并評價了其亞麻脫膠能力。主要研究內容如下：
　　1、根據(jù)GenBank中枯草芽孢桿菌淀粉酶基因amyE、啟動子p43以及vgb基因的序列，利用引物設計軟件Primer Premier5.0分別設計引物 amyE-up1、amyE-up2（上游同源重組臂引物）；amyE-down1、amyE-down

4、2（下游同源重組臂引物）；p1、p2（p43啟動子引物）；vgb1、vgb2（vgb基因引物）。根據(jù)pHSG-398質粒圖譜分別設計引物 cm1、cm2（氯霉素抗性基因引物）。在上述引物5’端分別加入酶切位點：amyE-up1(XhoI)，amyE-up2(HindIII)，amyE-down1(XbaI)，amyE-down2(SacI)，p1(EcoRI)，P2(BamHI)，vgb1(BamHI)，vgb2(XbaI)，cm1(H

5、indIII)，cm2(EcoRI)。
　　2、分別以amyE-up1、amyE-up2，amyE-down1、amyE-down2和p1、p2為引物，以Bacillus subtilisA5基因組為模板，擴增得到amyE上下游片段作為同源重組臂和 p43啟動子。以 cm1、cm2為引物，以 pHSG-398質粒為模板擴增得到氯霉素抗性基因（cm），與的片段和 vgb1、vgb2為引物，以 pMD-vgb質粒為模板，得到中得到 v

6、gb基因。以上基因片段經(jīng)過純化，分別以相應的限制性內切酶切割，插入 pSK載體中，得到含有 vgb基因的pSK質粒（pSK-vgb(+)）。
　　3、將所得到的pSK-vgb(+)質粒進行XhoI單酶切線性化、堿性磷酸酶處理去磷酸化，采用電轉法轉化（2.0kv，4.5ms-5ms）野生型Bacillus subtilisA5細胞。37℃，200 rpm振蕩培養(yǎng)，復蘇3小時后，培養(yǎng)在含有10ug/ml的氯霉素 LB固體培養(yǎng)基上涂布，

7、過夜培養(yǎng)，在此平板上生長的菌落初步確定為穩(wěn)定整合血紅蛋白基因的A5-vgb(+)工程菌株。
　　4、通過雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定vgb基因的正確插入。利用一氧化碳差光譜法測定血紅蛋白表達情況，結果表明表達的血紅蛋白具有活性。發(fā)酵搖瓶實驗研究 VHb對菌株果膠酶產(chǎn)量的影響， DNS法測定果膠酶酶活。結果150 rpm，37℃，pH=8.0，16小時發(fā)酵的條件下，vgb基因的表達促使 A5-vgb(+)菌株的果膠酶產(chǎn)量較不含vgb基