黑加侖提取物的抗氧化活性與應用及其對胃癌細胞增殖的抑制作用.pdf

1、目前，人工合成抗氧化劑被廣泛應用于食品中抑制脂肪氧化，并取得了很好的效果，但是，出于對食品安全性的考慮，其應用已受到限制，因此，研究開發(fā)植物來源的天然抗氧化劑以取代合成抗氧化劑具有十分重要的意義。黑加侖富含多種生物活性成分，如維生素、多酚、酚酸等，是天然抗氧化劑的良好來源，不僅能夠做為抗氧化劑應用在食品中，還具有有益人體健康的潛在功效，如抗癌、清除體內(nèi)自由基等。本課題以黑加侖凍果為原料，制備了具有強抗氧化活性和高花色苷含量的黑加侖提取物

2、，研究了提取物的抗氧化活性和穩(wěn)定性，以及在肉糜和色拉醬中的抗氧化效果，同時，還研究了黑加侖提取物誘導腫瘤細胞凋亡，以及對人胚肺成纖維細胞免于受到H2O2損傷的保護作用。研究內(nèi)容和研究結(jié)果如下：
　　 1、通過單因素試驗確定黑加侖提取物的最佳制備條件。選擇乙醇溶液為提取溶劑，最終確定乙醇體積分數(shù)為40％，提取時間2h，該條件下所得的提取物具有最佳的花色苷含量和抗氧化能力。將提取物于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得濃縮液中多酚含量為12.2 m

3、g/mL，花色苷含量為4.1 mg/mL，該濃縮液用于后續(xù)試驗。
　　 2、對黑加侖提取物的抗氧化活性進行評價，將25 mg/mL提取物與0.01% BHA和0.01%抗壞血酸的抗氧化能力分別進行對比，黑加侖提取物的還原能力、2，2-二苯基-1-間三硝基苯基聯(lián)肼(DPPH)自由基、2，2'-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)自由基和超氧自由基清除率均顯著高于抗壞血酸和BHA(P<0.05)，但是，提取物的羥

4、基自由基清除率顯著低于抗壞血酸和BHA(P<0.05)。
　　 2、應用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析黑加侖提物中的多酚成分。提取物中主要有6種花色苷，分別為矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、飛燕草素-3-O-蕓香糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、芍藥花青素-3-O-蕓香糖苷、天竺葵色素-3-O-蕓香糖苷，占總峰面積的52.1%，其中前四種花色苷占總花色苷的88.8%；其他多酚物質(zhì)分別為楊梅酮蕓香糖苷、楊梅酮葡萄

5、糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素葡萄糖苷、山奈黃素蕓香糖苷、異鼠李素蕓香糖苷和三柰酚葡萄糖苷，占總峰面積的47.9%。
　　 3、對黑加侖提取物的抗氧化穩(wěn)定性以及提取物中花色苷的穩(wěn)定性進行研究：
　　 (1)將花色苷含量為100 mg/mL的黑加侖提取物在60℃、80℃和100℃加熱1～5h，測定提取物的花色苷含量和抗氧化活性，結(jié)果表明，加熱導致提取物中的花色苷含量降低，其降解符合一級動力學反應，隨著溫度的增加，反

6、應速率常數(shù)k增加，半衰期t1/2降低，反應活化能為71.97 KJ/mol。隨著加熱溫度的升高和加熱時間的延長，花色苷的DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基和羥基自由基清除率以及還原能力均有不同程度的下降，溫度越高、加熱時間越長，降低的越多。
　　 (2)將花色苷含量為100 mg/mL的黑加侖提取物在室外自然光、室內(nèi)自然光和避光條件下放置至25 d，測定提取物中的花色苷含量和抗氧化活性，結(jié)果表明，光照導致提取物中的花色苷

7、含量逐漸降低，降低順序為：室外自然光>室內(nèi)自然光>避光?；ㄉ盏慕到夥弦患墑恿W反應，室外自然光放置時，一級反應速率常數(shù)k最高，半衰期t1/2最短，室內(nèi)自然光放置和避光放置的反應速率常數(shù)均較自然光放置的低，半衰期也增加。光照方式對提取物清除DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基、羥基自由基的能力和還原能力的降低順序為：室外自然光>室內(nèi)自然光>避光，且放置時間越長，抗氧化能力降低的越多。
　　 (3)將pH3～7的黑加侖提取

8、物于室內(nèi)自然光條件下放置至15 d，測定花色苷含量、DPPH自由基、ABTS自由基清除率和還原能力。結(jié)果表明，不同pH提取物呈現(xiàn)不同的顏色，pH增大，最大吸收波長發(fā)生紅移，pH低時，抗氧化能力比較穩(wěn)定，在放置過程中降低的幅度較小，pH高時，抗氧化能力降低的較快。
　　 4、將添加量為5 g/kg、10 g/kg和20 g/kg的黑加侖提取物添加到肉糜中，4℃冷藏9d，測定肉糜的TBARS值、羰基含量、巰基含量和色差值。結(jié)果表明，

9、黑加侖提取物能夠降低肉糜的TBARS值，抑制脂肪氧化，且添加量越大，抑制效果越強；提取物能夠降低羰基的含量和減少巰基的損失，抑制了蛋白的氧化，但抑制效果不如抑制脂肪氧化的效果明顯；此外，黑加侖提取物能增加肉糜的紅度值，保持肉糜鮮紅的色澤。
　　 5、將添加量為2.5、5和10 g/kg的黑加侖提取物添加到色拉醬中，25℃貯藏6周，測定色拉醬的POV值、TBARS值、粘度和紅度值。結(jié)果表明，黑加侖提取物能降低色拉醬的POV值和TB

10、ARS值，抑制脂肪氧化，同時，也能降低色拉醬的粘度，提高紅度值。對多酚和花色苷在液相中分布的測定結(jié)果表明，大部分多酚和花色苷分布在液相中，在液相發(fā)揮其抗氧化作用。
　　 6、將2.5、5、10、15和20 mg/mL的黑加侖提取物作用于胃癌SGC-7901細胞12、24和48 h，提取物能夠以劑量依賴和時間依賴的方式抑制細胞增殖，12、24和48h時的IC50分別為12.7，10.2和9.0 mg/mL；通過倒置顯微鏡和熒光顯微

11、鏡觀察到，經(jīng)黑加侖提取物作用以后，細胞出現(xiàn)典型的凋亡特征，細胞收縮，胞質(zhì)濃縮，形成胞漿絲，細胞核固縮濃染，熒光強度增加，部分細胞顏色發(fā)白，呈碎塊狀致密濃染；流式細胞檢測結(jié)果進一步說明了黑加侖提取物能夠誘導SGC-7901細胞發(fā)生凋亡。
　　 7、黑加侖提取物對人胚肺成纖維細胞MRC-5具有保護作用，使其較少受到H2O2的損傷作用。黑加侖提取物能夠提高細胞的存活率，熒光顯微鏡觀察和流式細胞檢測結(jié)果說明發(fā)生凋亡的細胞數(shù)量減少，并且，