DNA在基因診斷和重金屬離子分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施,基因診斷成為分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和遺傳學(xué)研究中的重要課題。基于DNA堿基互補(bǔ)配對發(fā)展起來的各種DNA電化學(xué)傳感技術(shù)引具有操作簡便快速、信號靈敏,能與DNA生物芯片兼容等優(yōu)點(diǎn),在大規(guī)模的基因檢測中具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。自“水俁病”和“痛痛病”公害事件發(fā)生以來,重金屬污染引發(fā)全社會關(guān)注。在食品和環(huán)境中的監(jiān)測以及臨床毒理學(xué)中實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、靈敏、現(xiàn)場跟蹤檢測重金屬離子成為一項(xiàng)緊迫的任務(wù)。隨著人們對DNA與金屬離子相互作用的深

2、入研究,發(fā)現(xiàn)DNA與金屬離子存在著特異性相互作用,這為重金屬離子的檢測提供了新途徑,使DNA在金屬離子生物傳感器的構(gòu)筑中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　本論文分為六章:
　　第一章:緒論
　　首先系統(tǒng)介紹了電化學(xué)生物傳感器的基本結(jié)構(gòu)、檢測原理、分類和應(yīng)用領(lǐng)域。然后重點(diǎn)介紹了DNA電化學(xué)傳感器的設(shè)計(jì),金納米粒子(AuNPs)、重氮化-偶聯(lián)反應(yīng)和重氮鹽還原反應(yīng)在構(gòu)筑DNA電化學(xué)生物傳感界面中的應(yīng)用。最后介紹了金屬離子與DNA相互

3、作用的研究進(jìn)展及在金屬離子生物傳感器構(gòu)筑中的應(yīng)用。
　　第二章:基于重氮化-偶聯(lián)反應(yīng)構(gòu)筑DNA電化學(xué)生物傳感器
　　本章基于重氮化-偶聯(lián)反應(yīng)提出了在電極表面組裝AuNPs的新方法并進(jìn)一步研究了其在DNA電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用,檢測痕量的乙肝病毒DNA片段。在電極表面自組裝4-氨基苯硫酚(4-ATP)分子后,經(jīng)重氮化-偶聯(lián)反應(yīng)使兩個(gè)4-ATP分子以首尾相接的方式固定在金電極上,得到巰基重氮氨基苯單分子層修飾電極。該修飾單層含有

4、大量巰基,為進(jìn)一步固定AuNPs提供了結(jié)合位點(diǎn)。研究了AuNPs修飾電極上DNA探針的固定和雜交。由于巰基重氮氨基苯單層具有大的共軛結(jié)構(gòu),提高了傳感體系的導(dǎo)電性,加速了電活性物質(zhì)與電極表面的電子轉(zhuǎn)移。以[Co(phen)3]3+為電化學(xué)指示劑,利用微分脈沖伏安法測定該DNA電化學(xué)生物傳感器對目標(biāo)DNA的線性檢測范圍為3.01×10-10～1.32×10-8M,檢測限為9.10×10-11M。另外,該DNA電化學(xué)生物傳感器具有良好的選擇性

5、、再生性和穩(wěn)定性。
　　第三章:基于電還原重氮陽離子構(gòu)筑新型DNA電化學(xué)生物傳感器
　　本章基于電還原重氮陽離子發(fā)展了在玻碳電極(GCE)表面組裝AuNPs的新方法并進(jìn)一步用于構(gòu)筑新型DNA電化學(xué)生物傳感器。重氮化反應(yīng)生成巰基苯重氮陽離子經(jīng)電還原可在GCE表面形成穩(wěn)定的巰基重氮氨基苯修飾薄膜(MPF),AuNPs固定在該修飾膜表面后,為探針HS-ssDNA提供結(jié)合位點(diǎn),同時(shí)增強(qiáng)了傳感體系的導(dǎo)電性。以[Co(phen)3]3+

6、為雜交指示劑,利用電化學(xué)微分脈沖伏安法檢測DNA的雜交。由于AuNPs的放大作用和MPF的穩(wěn)定性,該傳感器對乙肝病毒DNA的檢測限為7.2×10-11M。并且該傳感器具有良好的選擇性、穩(wěn)定性和再生性。
　　第四章:切口內(nèi)切酶對汞離子調(diào)控的雙鏈DNA切割活性的研究
　　本章以切口內(nèi)切酶為模型,利用簡單的電化學(xué)策略研究內(nèi)切酶和外切酶對Hg2+調(diào)控的dsDNA切割活性的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明切口內(nèi)切酶可以識別Hg2+-dsDNA,

7、并在切點(diǎn)位置切割dsDNA的一條鏈,證明Hg2+可引發(fā)限制性酶對dsDNA的切割活性,推測該調(diào)控機(jī)制同樣適用于C-Ag+-C體系。
　　第五章:結(jié)晶紫作為G.四鏈體特異性結(jié)合探針選擇性電化學(xué)檢測鉛
　　本章基于Pb2+誘導(dǎo)富含G堿基的DNA序列從自由伸展的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镚-四鏈體的構(gòu)象變化,以結(jié)晶紫(CV)為電化學(xué)指示劑,構(gòu)筑了電化學(xué)檢測pb2+的傳感界面。利用電化學(xué)手段研究了CV在G-四鏈體-CV復(fù)合物中的電化學(xué)性質(zhì)。圓二色譜

8、進(jìn)一步證明了DNA序列在加入pb2+后產(chǎn)生的構(gòu)象變化。CV嵌插到G-四鏈體中,產(chǎn)生明顯的電化學(xué)信號。該傳感器對pb2+的線性響應(yīng)范圍為1.0nM～1.0μM,檢測限為0.4nM。該傳感器簡單可靠、響應(yīng)快速、選擇性好,為臨床血鉛濃度的檢測提供了新途徑。
　　第六章:基于目標(biāo)物引發(fā)DNA釋放構(gòu)筑高選擇性鉛離子電化學(xué)生物傳感器
　　本章基于目標(biāo)物引發(fā)DNA釋放提出了構(gòu)筑新型高靈敏度、高選擇性電化學(xué)檢測鉛離子(Pb2+)的策略。首先

9、,將金電極放入含有2.8mM HAuCl4和0.1MH2SO4的溶液中,施加-1.5V的電位,直接在金電極表面進(jìn)行電沉積,得到樹枝狀金納米粒子修飾的金電極。這有助于提高電極的活性面積,從而增加含有巰基官能團(tuán)的捕獲DNA分子的固定量。當(dāng)該捕獲。DNA分子與pb2+特異性適體雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu),亞甲基藍(lán)(MB)嵌插到結(jié)構(gòu)中,產(chǎn)生電化學(xué)信號。當(dāng)加入pb2+之后,Pb2+與其適體結(jié)合形成pb2+穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu),從電極表面釋放到溶液中。同時(shí),