銅抗性全細(xì)胞傳感器的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、{，妻避l竹學(xué)校代碼： 1 0 1 3 5論文分類號(hào)：X 8 3 0 ．2學(xué) 號(hào)：2 0 0 8 4 0 1 6 0 2 0研究生類別： 全日制幽喜之解貉犬謦碩士學(xué)位論文銅抗性全細(xì)胞傳感器的構(gòu)建和表達(dá)U o n s t r u c t i o na n n e X D r e s s l o no IU o p p e r r e s l s t a n c eJ 叫 ．● ' ● n J 叫 ●w h o l e ．．c e

2、l ls e n s o r s學(xué)科門(mén)類：一級(jí)學(xué)科：學(xué)科、專業(yè)：研究方向：申請(qǐng)人姓名：指導(dǎo)教師姓名：二。一一年四月十日l(shuí)聾●一J礦，：_-．■b．▲歹中文摘要㈣㈣I ㈣Ir | I I l | l ril㈣l 1 1 1 1 1 |Y 1 8 9 1 。9 。1 ‘4 。利用聚合酶列式反應(yīng)( P C R ) 從大腸桿菌中擴(kuò)增到類銅的特異性啟動(dòng)子C o p A 和銅調(diào)控蛋白C u e R 基因，以綠色熒光蛋白( G F P ) 為報(bào)告基因

3、，p G E M 為載體，構(gòu)建成離子誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒C G P N P C T ，轉(zhuǎn)．化入大腸桿菌D H 5 a 宿主菌體中，加入銅離子誘導(dǎo)表達(dá)，測(cè)定其對(duì)重金屬銅及其衍生物的耐受性。成功制備了抗重金屬銅的工程菌株，研究了工程菌株的熒光強(qiáng)度與銅離子濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的關(guān)系，以及工程菌的性質(zhì)，以考察工程菌．株用于快速檢測(cè)重金屬銅的可行性。工程菌株的研究結(jié)果如下：1 ．以含C G P N P C T 質(zhì)粒的D H 5 0 t 在無(wú)銅誘導(dǎo)時(shí)綠色熒光蛋白

4、的表達(dá)量為對(duì)照，加入C u 2 + 誘導(dǎo)4 h 后，測(cè)定表達(dá)熒光的吸收光譜，可見(jiàn)在4 8 0 —5 2 0 n m 有吸收峰。·2 ．工程菌D H 5 a ( C G P N P C T ) 在培養(yǎng)基中加入不同終濃度的C u 2 +誘導(dǎo)4 h 發(fā)現(xiàn)，隨著銅離子( C u 2 + ) 濃度的增加，誘導(dǎo)的熒光表達(dá)量逐漸上升，銅離子在1 ．5 m m o l ／L 時(shí)達(dá)到最高值，然后下降，3 m m o l ／L達(dá)到平衡，在0 ,

5、- - - ，4m m o l ／L 范圍內(nèi)，．熒光強(qiáng)度和離子濃度呈正相關(guān)。3 ．工程菌D H 5 0 t ( C G P N P C T ) 在培養(yǎng)基中加入不同濃度的C u 2 +做誘導(dǎo)，在O ．1 2 個(gè)小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)每?jī)蓚€(gè)小時(shí)取樣測(cè)定熒光值，．?dāng)?shù)據(jù)顯示，熒光值隨C u 2 + 濃度增大呈明顯上升趨勢(shì)。銅離子( C u 2 + ) 濃度相同時(shí)，隨著時(shí)間梯度的變化，熒光值穩(wěn)定上升，與時(shí)間呈正比。4 ．分別采用6 種重金屬離子( C u

6、 2 + 、A s 5 + 、C d 2 + 、C r 3 + 、H 9 2 + 、P b 2 + ) 對(duì)工程菌株進(jìn)行誘導(dǎo)，測(cè)定熒光強(qiáng)度考察工程菌株對(duì)銅離子的特異性。發(fā)現(xiàn)，工程菌株對(duì)銅以外的重金屬離子基本沒(méi)有響應(yīng)，說(shuō)明工程菌株對(duì)銅離子具有較強(qiáng)的特異性。上述結(jié)果表明，以綠色熒光蛋白基因?yàn)閳?bào)告基因的工程菌株D H 5 a ( C G P N P C T ) 有望建立起一種方便快捷的重金屬銅的檢測(cè)方法一微生物全細(xì)胞傳感器法，具有很高的應(yīng)用價(jià)值