幾種商品化糖胺聚糖降解酶的克隆表達及其應用.pdf

1、糖胺聚糖(GAGs)又稱為粘多糖，是聚陰離子雜多糖的一種，主要存在于結(jié)締組織中，是一種線性的生物大分子，按照其二糖組成不同可以分為硫酸軟骨素/硫酸皮膚素(CS/DS)、肝素/硫酸乙酰肝素(HP/HS)及透明質(zhì)酸(HA)等。GAGs在各種生命過程中發(fā)揮著重要的功能，包括:抗凝活性、神經(jīng)系統(tǒng)修復、調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導等。
　　目前肝素主要從豬小腸粘膜中提取，提取過程中會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，即類肝素(HPND)，主要是HS/HP、DS和少量的

2、CS。由于HPND中各種GAGs的理化性質(zhì)極為相似，很難將它們相互分離，實現(xiàn)高值化利用。舒洛地特(SLDX)是一種由HS/HP和DS組成的抗血栓藥物，由于其抗栓效果好，副作用小，被廣泛使用，但目前完全依賴進口，價格昂貴。本研究我們將通過克隆表達一系列高活力商品化GAGs降解酶，用以從HPND中純化HS/HP，并結(jié)合分級沉淀的方法，探索SLDX的仿制工藝，并初步比較了仿制藥與原研藥的生物活性。
　　具體如下:
　　1.GAGs

3、降解酶的克隆表達與純化:本研究以Flavobacterium heparinum基因組為模板，通過基因擴增，表達載體構(gòu)建，菌株誘導以及蛋白表達與純化得到三種蛋白，分別為:肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。其中:肝素酶Ⅰ的表達量為300-320 mg/L，酶活為90-100 IU/mg;肝素酶Ⅲ的表達量為240-260 mg/L，酶活為80-90 IU/mg。從Proteus vulgaris NCTC4636菌株中純化硫酸軟骨素酶ABC，酶活為4000

4、 IU/L。從本實驗室發(fā)現(xiàn)的菌株Vibrio sp.FC509克隆表達HCLase，其對HA的酶活為450，000IU/mg，對CS的酶活為330，000IU/mg。
　　2.SLDX的分析及仿制:分子量分析與及二糖組成分析實驗表明，SLDX的分子量分布范圍很寬，主要含有HS/HP(～80％)和DS(～20％)。HS/HP二糖中主要含有6種類型的二糖結(jié)構(gòu)。其中三硫酸化二糖(HexUA(2S)-GlcN(NS，6S))以及非硫酸化二

5、糖(HexUA-GlcNAc)比例最高，分別為38.03％與19.35％。DS則主要由HexUA1-3 GalNAc(4S)組成。據(jù)此，我們利用生物酶法從HPND純化得到高純度的HP以及HS，并結(jié)合HPND的沉淀分級，探討了SLDX的仿制工藝，初步仿制了SLDX。
　　3.仿制藥與SLDX的生物活性比較:抗FⅡa與FⅩa因子實驗表明，SLDX的抗FⅩa與FⅡa活性分別為74.23 IU/mg與60.54 IU/mg，仿制藥的抗FⅩ

6、a與FⅡa值分別為62.29 IU/mg與58.11 IU/mg，SLDX的FⅩa/FⅡa為1.22，仿制藥為1.07。大鼠體內(nèi)促LPL釋放活性實驗表明:SLDX的促LPL釋放活性為174.3 mU/ml，仿制藥為164.9 mU/ml。
　　綜上所述，本課題成功克隆表達和純化了多個具有重要應用價值的高活性GAGs降解酶，并在此基礎(chǔ)上，以HPND為原料，探討了抗血栓藥舒絡(luò)地特的仿制工藝，初步制得了在組成和活性上與原研藥相似的仿制品