新型酶?jìng)鞲衅鞯难芯考捌湓诃h(huán)境毒物分析中的應(yīng)用.pdf

1、生物傳感器在臨床診斷、生物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，因而吸引了眾多研究者的興趣。近年來隨著人們環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)，對(duì)環(huán)境檢測(cè)提出了更高的要求。酶?jìng)鞲衅鳚M足了現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境監(jiān)測(cè)和化學(xué)戰(zhàn)劑快速檢測(cè)的需要，已逐步應(yīng)用于環(huán)境毒物的測(cè)定。在生物傳感器的構(gòu)建中,其關(guān)鍵技術(shù)之一就是如何將生物分子穩(wěn)定、高活性地固定到換能器表面。本文針對(duì)生物傳感器固定技術(shù)中存在的生物分子失活的問題，發(fā)展了一系列固定基質(zhì)材料和固定方法以提高固定化生物分子的活性，并以之

2、為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)制備了過氧化氫、葡萄糖、尿素的酶?jìng)鞲衅鳎涣硗?，利用聚電解質(zhì)的尺寸排除效應(yīng)解決樣品中抗壞血酸的干擾；利用納米金的吸附-解吸作用對(duì)失活酶層進(jìn)行更新，構(gòu)建了一系列一體化的單酶電極用于環(huán)境毒物的測(cè)定。其次，本文還采用酶標(biāo)雜交法研制了一種與結(jié)腸癌高度相關(guān)的基因傳感器。具體內(nèi)容如下：1.發(fā)展了4種固定生物分子的新方法并用于固定酶構(gòu)建電化學(xué)酶?jìng)鞲衅?。?）在第2章中，首次研制出一種基于納米ZnO/殼聚糖有機(jī)-無機(jī)復(fù)合膜作為固定基質(zhì)的酶生物傳

3、感器。該復(fù)合膜結(jié)合了無機(jī)材料納米ZnO和有機(jī)材料殼聚糖的優(yōu)點(diǎn)。酶的固定基于納米ZnO的吸附作用，因此避免了使用戊二醛時(shí)對(duì)酶的化學(xué)損傷。選擇典型的辣根過氧化酶作為研究對(duì)象。通過掃描電鏡觀察到納米ZnO/殼聚糖膜呈多孔狀，可使辣根過氧化酶有效地包埋在膜中，比用戊二醛交聯(lián)的酶具有更高的生物活性。電極測(cè)定H2O2溶液的濃度線性范圍是5.0×10-5~2.0×10-3mol/L，靈敏度為43.8μALmmol-1，在3σ處得檢測(cè)下限為2.5′10

4、-6mol/L。此基質(zhì)可用于其它生物分子的固定。（已成功用于固定抗體制得免疫傳感器）（2）在前面的研究中，我們從掃描電鏡圖中發(fā)現(xiàn)ZnO在殼聚糖中分散的均勻性有待提高。在第3章中報(bào)道了一種基于改性納米ZrO2/殼聚糖復(fù)合膜作為固定基質(zhì)的葡萄糖傳感器。首次將納米ZrO2用陰離子表面活性劑加以處理以提高其在殼聚糖溶液中的分散性。當(dāng)葡萄糖溶液濃度在1.25×10-5~9.50×10-3mol/L變化時(shí)，電極呈線性響應(yīng)，靈敏度為0.028μALm

5、mol-1。在3σ處得檢測(cè)下限為1.0×10-5mol/L（3）在第4章中報(bào)道了一種新型尿素傳感器。以胺化PVC（PVC-NH2）作基質(zhì)的PVC膜pH電極為原電極，首先采用戊二醛將伴刀豆球蛋白交聯(lián)到pH電極上，再利用伴刀豆球蛋白（ConA）與糖蛋白間的特異性識(shí)別作用，將ConA和酶表面的麥芽糖殘基結(jié)合，采用交替沉積ConA和脲酶，進(jìn)行多層酶膜的組裝，電極在尿素濃度為6.9′10-5~1.0′10-3mol/L范圍，響應(yīng)電位與尿素濃度的對(duì)

6、數(shù)值間成線性關(guān)系，檢測(cè)下限為4.5′10-5mol/l。（4）實(shí)現(xiàn)酶與電極之間直接電子傳遞要比普通氧化還原蛋白(如細(xì)胞色素C)困難得多，一直是生物電化學(xué)工作者努力的方向。利用納米金的比表面積大，表面活性中心多，催化效率高，吸附能力強(qiáng)，生物相容性及導(dǎo)電性良好等優(yōu)異性質(zhì)，在第五章中研制了一種新型第三代HRP酶?jìng)鞲衅鳌Ｊ紫炔捎眉{米金吸附辣根過氧化物酶（HRP），并利用ConA與糖蛋白間的特異性識(shí)別作用，將ConA和酶表面的麥芽糖殘基結(jié)合來進(jìn)行

7、酶膜的組裝，借助納米金的催化性實(shí)現(xiàn)了HRP酶的直接電化學(xué)，。電極測(cè)定H2O2的線性范圍為5.0×10-6~1.3×10-4mol/L，檢測(cè)下限為2.9×10-6mol/L。2.利用抑制劑對(duì)酶活性的抑制作用，將不同的酶?jìng)鞲衅饔糜谄湟种苿┑臏y(cè)定，檢測(cè)了幾種環(huán)境毒物。（1）在第6章中,研制了一種基于尼古丁對(duì)膽堿氧化酶活性抑制的尼古丁生物傳感器并用于真實(shí)樣品中尼古丁的測(cè)定。將膽堿氧化酶與BSA共價(jià)交聯(lián)直接固定在碳糊電極上制得電流型膽堿氧化酶電極

8、，同時(shí)使用1,4-苯醌作為電子媒介從而避免使用氧氣或過氧化氫電極作為內(nèi)部換能器。尼古丁抑制酶的活性從而減少氧化電流。根據(jù)尼古丁使電流減小的程度，實(shí)現(xiàn)了對(duì)尼古丁的定量測(cè)定。檢測(cè)到尼古丁的下限為1.0×10-5molL－1，測(cè)定尼古丁的線性范圍為2.0×10-5~9.2×10-4molL－1。（2）在第7章中，首先將半胱胺通過巰基自組裝在金電極表面形成單層膜（SAM），再將HRP交聯(lián)固定在半胱胺單層膜上制得過氧化氫生物傳感器并用于硫化物的測(cè)

9、定。硫化物抑制HRP酶的活性使還原電流減小，根據(jù)電流減小的程度實(shí)現(xiàn)了對(duì)硫化物的測(cè)定。自組裝單層膜只能固定有限的酶使得傳感器對(duì)抑制劑非常敏感，有利于改進(jìn)傳感器的檢測(cè)下限。結(jié)果顯示，此傳感器，分析響應(yīng)性能良好。檢測(cè)硫化物的線性范圍為0.5~12.7μmolL-1，檢測(cè)下限為0.3μmolL-1，優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道值。計(jì)算了表觀米氏常數(shù)并推導(dǎo)了可能的抑制機(jī)理.傳感器的穩(wěn)定性和選擇性良好，壽命較長(zhǎng)。由于硫化物對(duì)HRP酶的抑制是可逆抑制，因此酶電極可以

10、多次重復(fù)使用。（3）在第8章中首次報(bào)道一種基于多層聚電解質(zhì)殼聚糖/聚苯磺酸鈉(CHIT/PSS)提高對(duì)抗壞血酸選擇性的安培型乙酰膽堿酯酶（AChE）生物傳感器并將其用于其抑制劑有機(jī)磷農(nóng)藥的測(cè)定。該傳感器基于巰基乙酰膽堿在酶的催化水解下所產(chǎn)生的巰基膽堿的電化學(xué)氧化，而有機(jī)磷農(nóng)藥抑制乙酰膽堿酯酶的活性，導(dǎo)致氧化電流的減小。根據(jù)電流減小的程度實(shí)現(xiàn)了對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的測(cè)定。電極測(cè)定農(nóng)藥辛硫磷響應(yīng)的線性范圍是6.6′10-6~4.0′10-4molL

11、-1,檢測(cè)下限為1.3′10-6molL-1；測(cè)定馬拉硫磷的線性范圍為4.1′10-8~5.9′10-7molL-1,檢測(cè)下限為5.0′10-9molL-1；測(cè)定樂果的線性范圍為8.6×10-6~5.2×10-4molL-1,檢測(cè)下限為1.7×10-6molL-1。（4）研究表明，重金屬離子對(duì)脲酶的抑制作用是不可逆的，因此基于對(duì)脲酶抑制來檢測(cè)汞離子的傳感器在多次與抑制劑接觸后，很難使用再生溶液將脲酶的活性完全恢復(fù)，有必要研究一種可更新的

12、脲酶?jìng)鞲衅?。在?章中，提出了一種基于自組裝納米金的可更新的抑制型汞離子傳感器，其基礎(chǔ)電極為胺化-聚氯乙烯（PVC-NH2）膜pH電極。首先將納米金組裝在含有中性載體DAMAB的PVC-NH2膜表面，然后通過化學(xué)吸附作用將脲酶固定在納米金上制得脲酶電極并用于檢測(cè)汞離子。電極對(duì)汞離子響應(yīng)的線性范圍為0.09至1.99μmolL-1，檢測(cè)下限為0.08μmolL-1。自組裝固定的一個(gè)有利之處就是在傳感器表面被Hg2+變性的失活酶層和納米金能

13、被通過強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液去除干凈，并可重新進(jìn)行下一循環(huán)的酶自組裝。3.結(jié)腸癌在北美、西歐、澳大利亞、新西蘭等地的發(fā)病率最高，居內(nèi)臟腫瘤前二位。常用的檢測(cè)結(jié)腸癌的方法不夠靈敏，很難進(jìn)行早期癌癥診斷，這對(duì)于及早治療很不利。在第10章報(bào)道了一種高靈敏DNA傳感器用于檢測(cè)與結(jié)腸癌高度相關(guān)的基因。采用自組裝的方法在金電極表面固定修飾有巰基的捕獲DNA探針,并用共價(jià)交聯(lián)法將辣根過氧化物酶標(biāo)記到修飾有氨基的檢測(cè)DNA探針上,通過夾心法來檢測(cè)與結(jié)腸癌高度相關(guān)