抗腫瘤抗生素鏈黑菌素生物合成機制研究.pdf

1、鏈黑菌素是一個由絨毛鏈霉菌產(chǎn)生的具有獨特的氨基喹啉醌式結(jié)構(gòu)的抗腫瘤抗生素。鏈黑菌素與和具有類似結(jié)構(gòu)和活性的鏈黑菌酮,淡紫醌霉素以及其他四個天然的結(jié)構(gòu)類似物構(gòu)成了一個抗生素家族,命名為“streptonigrinoids”。鏈黑菌素由四個環(huán)構(gòu)成,其中三個環(huán)共處于一個平面,第四個環(huán)則與這個平面垂直。鏈黑菌素具有多種生物活性,包括廣譜的抗菌和抗病毒活性,最重要的是它具有廣譜的抗腫瘤活性,尤其對急性白血病、惡性淋巴瘤及其他骨髓增生性疾病均有較好

2、的療效。鏈黑霉素抑制腫瘤的機制有多種,它可以抑制 DNA和RNA的生物合成,誘導DNA單鏈或雙鏈斷裂,誘導 DNA的非程序化合成及與DNA形成復合體,抑制DNA拓撲異構(gòu)酶II。然而,鏈黑霉素具有較為明顯的骨髓抑制副作用,限制了其在臨床上的廣泛應用。因此,鏈黑菌素吸引了化學家和生物學家的極大關注,化學家通過全合成方法合成了多種鏈黑菌素類似物期望能夠降低其毒性以利于臨床應用。有關鏈黑菌素生物合成的早期研究集中于利用同位素喂養(yǎng)實驗揭示了鏈黑菌

3、素的生物來源,而仍無法企及其生物合成的分子機制。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、爬没蚪M測序技術(shù)獲得了鏈黑菌素產(chǎn)生菌基因組序列,以苯丙氨酸β-碳甲基轉(zhuǎn)移酶MppJ為探針,篩選到了鏈黑菌素的生物合成基因簇并通過大片段缺失實驗予以證實。我們利用基因敲除確定了以stnA為上邊界和stnT4為下邊界,含有48個基因的鏈黑菌素生物合成基因簇。生物信息學分析揭示該基因簇含有四個SAM依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶基因,四個亮氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶基因(LCM),十

4、三個氧化還原酶基因,四個參與合成3-羥基安息香酸的基因,以及多個調(diào)控、抗性和未知功能基因。我們對基因簇中的21個基因進行了敲除,分離鑒定了11個鏈黑菌素生物合成中間體或類似物。stnA基因的失活菌株積累了3,4和5三個鏈黑菌素結(jié)構(gòu)類似物,并通過喂養(yǎng)實驗證實這三個化合物是鏈黑菌素的生物合成中間體。突變株DstnT4和DstnF3-4積累化合物6,喂養(yǎng)實驗證實6同樣能回補鏈黑菌素的產(chǎn)生,推測其為水解酶StnA催化3水解的產(chǎn)物。
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5、stnB1編碼芳香環(huán)雙氧化酶的a-亞基,其突變株DstnB1積累淡紫醌霉素7及其甲酯8,此外,HPLC分析顯示β-咔啉堿oxapropaline D15在該突變株中的產(chǎn)量比原始菌株有所提高。喂養(yǎng)實驗證實7和8能夠參與鏈黑菌素的生物合成而15不能,由此可以證實淡紫醌霉素7及其甲酯8是鏈黑菌素的生物合成中間體,而15可能是鏈黑菌素生物合成途徑中非程序性脫酸形成的副產(chǎn)物。
　?、窃陔娮庸w聯(lián)亞硫酸鈉存在下,我們利用StnB1及芳香環(huán)雙氧

6、化酶的b-亞基StnB2在體外實現(xiàn)了7和8的氧化開環(huán)形成化合物9和10,初步證實了芳環(huán)雙氧化酶StnBs負責吲哚環(huán)N-C8￠鍵的開環(huán)和雙羥基化。此外,化合物7和8的共底物生化研究表明,化合物8可能是StnBs體系的最適底物。根據(jù)以上的喂養(yǎng)實驗和生化研究,我們初步推測淡紫醌霉素7經(jīng)甲酯化形成8,然后在芳環(huán)雙氧化酶StnBs催化下開環(huán)形成鏈黑菌素生物合成的直接前體。
　?、萻tnF1-F4編碼亮氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶。在這四個基因的敲除突變

7、菌株中,只有DstnF1喪失了鏈黑菌素的生產(chǎn),DstnF2仍產(chǎn)生少量的鏈黑菌素,DstnF3-4均積累化合物6及微量鏈黑菌素。據(jù)此,我們推測StnF1或者StnF2可能負責了淡紫醌霉素7的甲酯化形成化合物8,并通過生化實驗證實是StnF2而不是StnF1負責了7的甲酯化。我們還完成了四個編碼SAM依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶基因的敲除。從編碼碳甲基轉(zhuǎn)移酶基因 stnQ1的失活突變菌株中,我們分離鑒定了3￠-去甲基鏈黑菌素13;stnQ2的失活完全終

8、止了鏈黑菌素的生產(chǎn);stnQ3的失活突變菌株積累了化合物11,6-甲氧基化的化合物10;我們從 stnQ4的失活突變菌株的發(fā)酵液中分離鑒定了10￠-去甲基鏈黑菌素12。然而喂養(yǎng)實驗表明11不是鏈黑菌素生物合成的中間體,可能是一個副產(chǎn)物。此外,我們完成了其他4個基因的突變失活,這些突變菌株或者不影響鏈黑菌素的生產(chǎn),或者中斷了鏈黑菌素的生產(chǎn),但不積累任何與鏈黑菌素生物合成相關的化合物,那么這些基因編碼的酶蛋白催化的反應可能位于鏈黑菌素生物合