近紅外硅基羅丹明——合成方法學(xué)及熒光探針的構(gòu)建與成像研究.pdf

1、近年來(lái)，熒光成像技術(shù)為人們研究活體細(xì)胞及組織內(nèi)的化學(xué)生物學(xué)過(guò)程提供了有效的研究工具，可以無(wú)損、實(shí)時(shí)、原位地以高時(shí)空分辨率實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行生物熒光成像與分析。熒光成像技術(shù)在生物學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、臨床診斷和藥物發(fā)現(xiàn)等諸多研究領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。生物熒光成像技術(shù)的最新進(jìn)展對(duì)發(fā)展新型小分子熒光染料及探針提出了更高的要求。激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)位于近紅外光區(qū)(600-900 nm)的熒光染料及探針由于具有光毒性低、生物分子自發(fā)熒光干擾小、光散射低、組

2、織穿透能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，非常適合用于生物熒光成像領(lǐng)域。
　　研究表明，通過(guò)將羅丹明分子中O橋原子用SiMe2代替，得到了硅基羅丹明熒光染料。這類(lèi)染料分子在保留了羅丹明熒光染料優(yōu)越的光學(xué)性質(zhì)的同時(shí)，光譜發(fā)生明顯紅移，滿足了近紅外熒光檢測(cè)的要求，具有良好的生物相容性。在本論文中，我們致力于構(gòu)建基于硅基羅丹明的近紅外熒光成像平臺(tái)。
　　一、硅基羅丹明染料合成方法學(xué)研究
　　現(xiàn)有硅基羅丹明染料的合成方法操作復(fù)雜，產(chǎn)率較低，且底物選

3、擇范圍有限，大大限制了硅基羅丹明熒光探針的發(fā)展。為了解決這一問(wèn)題，我們進(jìn)行了硅基羅丹明合成方法學(xué)的研究工作，開(kāi)發(fā)了一條全新的硅基羅丹明合成路線。通過(guò)二芳基硅醚中間體與取代苯甲醛反應(yīng)，構(gòu)建硅基羅丹明母核。通過(guò)該合成方法，我們大大擴(kuò)充了硅基羅丹明染料的種類(lèi)，合成了擴(kuò)環(huán)的和具有不對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的硅基羅丹明衍生物，并且成功構(gòu)建了含有以前方法難以引入基團(tuán)（如-Br，-NO2等）的硅基羅丹明衍生物。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)Click反應(yīng)，將細(xì)胞線粒體靶向基團(tuán)引入

4、到含炔基的硅基羅丹明分子中，合成出具有線粒體靶向功能的近紅外熒光探針，并成功應(yīng)用于活細(xì)胞線粒體的熒光成像實(shí)驗(yàn)中。
　　二、功能化硅基羅丹明近紅外熒光探針的構(gòu)建及成像研究
　　在合成方法學(xué)研究的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)并合成了功能化硅基羅丹明近紅外熒光探針，并應(yīng)用于活細(xì)胞近紅外熒光成像研究中。一方面，硅基羅丹明的螺環(huán)化已被證實(shí)是一種有效的設(shè)計(jì)“關(guān)-開(kāi)”型熒光探針的手段，具有熒光背景低和檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。另一方面，在對(duì)硅基羅丹明

5、的性質(zhì)進(jìn)行研究過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，相較于具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)的羅丹明分子，硅基羅丹明有著許多獨(dú)特的性質(zhì)，其中較為突出的一點(diǎn)是硅基羅丹明分子中的螺環(huán)具有特殊的穩(wěn)定性，特別是對(duì)H+有很強(qiáng)的耐受性。這使得硅基羅丹明在正常生理?xiàng)l件下和酸性環(huán)境中都有極低的熒光背景。因此，含有螺環(huán)結(jié)構(gòu)的硅基羅丹明分子能夠以較高的信噪比實(shí)現(xiàn)酸性條件下不同分析物的近紅外熒光成像。
　　由于溶酶體的酸性環(huán)境，往往會(huì)使一般的熒光探針產(chǎn)生背景熒光或者影響探針?lè)肿訉?duì)檢測(cè)物的響應(yīng)，使

6、得檢測(cè)靈敏度降低，因而能夠用于對(duì)細(xì)胞溶酶體中分析物進(jìn)行生物成像的小分子熒光探針少之又少。得益于硅基羅丹明分子中螺環(huán)特殊的穩(wěn)定性，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了具有溶酶體靶向功能的硅基羅丹明Cu2+探針SiRB-Cu和硅基羅丹明NO探針Lyso-SiRB-NO，分別對(duì)其光譜學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，并成功應(yīng)用于活細(xì)胞溶酶體內(nèi)Cu2+和NO的近紅外熒光成像實(shí)驗(yàn)中。
　　1、含六元螺環(huán)的硅基羅丹明靶向溶酶體Cu2+近紅外熒光探針
　　細(xì)胞溶酶體Cu2+

7、平衡的調(diào)節(jié)與許多生理和病理過(guò)程著密切的聯(lián)系，開(kāi)發(fā)一種能夠檢測(cè)細(xì)胞溶酶體內(nèi)Cu2+實(shí)時(shí)分布和濃度變化的熒光探針具有重要的研究?jī)r(jià)值。我們報(bào)道了一個(gè)含有六元胺基硫脲螺環(huán)的硅基羅丹明Cu2+探針——SiRB-Cu，胺基硫脲結(jié)構(gòu)不僅僅是Cu2+的結(jié)合和反應(yīng)位點(diǎn)，同時(shí)與可以起到溶酶體靶向的功能;螺環(huán)的穩(wěn)定性大大降低了探針SiRB-Cu在溶酶體中的檢測(cè)背景，提高了檢測(cè)靈敏度。探針SiRB-Cu實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞溶酶體內(nèi)外源性和內(nèi)源性Cu2+的近紅外熒光成像

8、。
　　2、具有溶酶體靶向功能的硅基羅丹明NO近紅外熒光探針
　　作為一種重要的信使分子，NO在溶酶體中的作用與許多病理生理過(guò)程有關(guān)。利用鄰苯二胺基團(tuán)作為NO的反應(yīng)識(shí)別位點(diǎn)，我們合成得到了基于螺環(huán)開(kāi)環(huán)原理的硅基羅丹明NO探針SiRB-NO;通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)引入嗎啉結(jié)構(gòu)，作為溶酶體靶向基團(tuán)，合成得到具有溶酶體靶向功能的NO近紅外熒光探針Lyso-SiRB-NO。探針Lyso-SiRB-NO具有一系列H+相關(guān)的性質(zhì):對(duì)H+較強(qiáng)的耐受

9、性、H+能夠促進(jìn)探針對(duì)NO的識(shí)別、H+能夠抑制熒光產(chǎn)物的水解、H+能夠使水解產(chǎn)物L(fēng)yso-SiRB的熒光增強(qiáng)等。探針Lyso-SiRB-NO以極低的熒光背景、較高的靈敏度、較好的選擇性和較好的時(shí)空分辨率分別實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞溶酶體內(nèi)NO的近紅外熒光成像。
　　與具有相應(yīng)結(jié)構(gòu)的羅丹明探針相比，硅基羅丹明探針SiRB-Cu和Lyso-SiRB-NO在細(xì)胞溶酶體成像中的成功應(yīng)用，證明了硅基羅丹明分子中螺環(huán)的特殊性質(zhì)可以成功的用于功能化近紅外熒光