生物轉(zhuǎn)化-化學(xué)催化級(jí)聯(lián)制備l-（+）-酒石酸.pdf

1、L-(+)-酒石酸是一種重要的羥基羧酸類(lèi)螯合劑，在制藥、食品、染料等工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。目前，L-(+)-酒石酸主要來(lái)源是釀酒行業(yè)中“酒石”的提取，或者利用順式環(huán)氧琥珀酸水解酶(cis-epoxysuccinate hydrolase，ESH)進(jìn)行酶法生產(chǎn)制備。前者受到原料的限制，而后者主要依賴(lài)于底物馬來(lái)酸酐，是一種以石化產(chǎn)品為原料的生產(chǎn)方式。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，世界范圍內(nèi)石油資源的日益枯竭，以及國(guó)際原油價(jià)格的不穩(wěn)定，這對(duì)以石油為原料的

2、化學(xué)品制造業(yè)造成了巨大的壓力，也使以生物質(zhì)可再生資源為原料的可持續(xù)生產(chǎn)加工方式在全球范圍內(nèi)引起了廣泛的關(guān)注。本論文在綜述L-(+)-酒石酸的性質(zhì)、用途、市場(chǎng)需求、生產(chǎn)方法及生物制造研究進(jìn)展等內(nèi)容的基礎(chǔ)上，針對(duì)以糖類(lèi)為原料的生物轉(zhuǎn)化-化學(xué)催化級(jí)聯(lián)制備L-(+)-酒石酸過(guò)程中反應(yīng)選擇性不高、產(chǎn)物綜合得率低等問(wèn)題，系統(tǒng)性地研究了5-酮-D-葡萄糖酸(5-KGA)高效合成Gluconobacter oxydans細(xì)胞工廠的構(gòu)建、發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化與控

3、制，以及5-KGA化學(xué)催化氧化制備L-(+)-酒石酸的工藝，提高了工藝的總體效率，為利用可再生資源生物制備L-(+)-酒石酸打下基礎(chǔ)。
　　本文首先在分析氧化葡萄糖酸桿菌Gluconobacter oxydans DSM2343生物合成5-KGA代謝途徑的基礎(chǔ)上，利用自殺質(zhì)粒pJKM，通過(guò)同源重組方式，先后無(wú)痕敲除葡萄糖酸-2-脫氫酶基因和丙酮酸脫羧酶基因，切斷2-KGA和副產(chǎn)物乙酸的代謝途徑，構(gòu)建工程菌G.oxydans ZJU

4、2。通過(guò)搖瓶實(shí)驗(yàn)，該菌5-KGA的產(chǎn)量為20.89 g/L，是出發(fā)菌株的2.65倍。通過(guò)分析工程菌G.oxydans ZJU2分批發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)參數(shù)μ、qs、 qp變化特性，設(shè)計(jì)一種簡(jiǎn)單、易操作的分階段溶氧控制策略，以獲得較高比生長(zhǎng)速率，實(shí)現(xiàn)5-KGA高產(chǎn)量、高產(chǎn)率的相對(duì)統(tǒng)一。在15-L發(fā)酵罐上，起始葡萄糖濃度為100 g/L，最終細(xì)胞干重為3.8 g/L，5-KGA的產(chǎn)量約為75.66 g/L，產(chǎn)率為1.72 g/L·h，摩爾轉(zhuǎn)化率為

5、70.21％，然而發(fā)酵體系中仍有23.19g/L的葡萄糖酸殘余，占初始葡萄糖的摩爾比為21.29％。
　　較高的中間產(chǎn)物葡萄糖酸積累量表明，葡萄糖酸向5-KGA轉(zhuǎn)化的反應(yīng)成了代謝途徑的限速步驟，過(guò)表達(dá)催化該反應(yīng)的酶可能有利于提高5-KGA的發(fā)酵水平。在優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)啟動(dòng)子元件的基礎(chǔ)上，分別克隆表達(dá)Gluconobacter的山梨醇脫氫酶基因及Xanthomonas campestris DSM3586的次級(jí)醇脫氫酶基因，對(duì)比分析工程

6、菌G.oxydans ZJU2/pBB5-P0169-gcd和G.oxydans ZJU2/pBB5-P0169-sldAB合成5-KGA的能力。發(fā)酵64 h后，5-KGA的產(chǎn)量分別為119.14g/L和123.78g/L，產(chǎn)率分別為1.86g/L·h和1.93g/L·h，摩爾轉(zhuǎn)化率分別為73.71％和76.58％。結(jié)果表明工程菌G.oxydans ZJU2/pBBR5-P0169-sldAB(G.oxydans ZJU3)更適合于5-

7、KGA的合成。
　　過(guò)表達(dá)依賴(lài)于輔酶PQQ的膜結(jié)合sldAB基因后，會(huì)造成宿主菌本身PQQ的水平和酶量之間的不平衡，從而限制sldAB基因表達(dá)的效果。利用穿梭質(zhì)粒pUCpr，在G.oxydans ZJU3中進(jìn)一步強(qiáng)化輔酶PQQ合成模塊及呼吸鏈電子傳遞模塊，最終工程菌G.oxydans ZJU7，其PQQ水平達(dá)757.83±2.43μg/L，H+/O為2.01±0.16，醌醇氧化酶活力為0.80±0.06μmol/min、mg pr

8、otein，同時(shí)5-KGA的批次發(fā)酵最高產(chǎn)量為144.52g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率約為84.07％，產(chǎn)率為2.26g/L、h（以發(fā)酵64h計(jì)算）。進(jìn)一步對(duì)工程菌發(fā)酵體系進(jìn)行過(guò)程控制優(yōu)化，如起始葡萄糖濃度、氮源、pH、溶氧DOT、 Ca2+等。在此基礎(chǔ)上，考察工程菌G.oxydans ZJU7流加補(bǔ)料條件，建立葡萄糖Fed-batch發(fā)酵工藝，發(fā)酵64h后，5-KGA的產(chǎn)量達(dá)到162g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為83.31％，產(chǎn)率為2.53g/L·h。<

9、br>　　以5-KGA為研究對(duì)象，考察堿性緩沖體系下化學(xué)催化5-KGA制備L-(+)-酒石酸的工藝。通過(guò)篩選，確定CuSO4·5H2O為催化劑，并優(yōu)化其用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等。在30℃，220rpm，CuSO4·5H2O用量為0.5 g/L的條件下，100g/L的5-KGA-K在堿性緩沖體系中連續(xù)反應(yīng)72h，5-KGA的摩爾轉(zhuǎn)化率可以達(dá)73％-75％，選擇率約為76.18％，相對(duì)于傳統(tǒng)的NH4VO3、貴金屬Pd-C等催化劑，具有成本