發(fā)芽糙米富硒特性及其硒蛋白抗氧化與抗腫瘤活性研究.pdf

1、本文對(duì)糙米發(fā)芽富硒特性及富硒發(fā)芽糙米硒蛋白的分離純化及其抗氧化與抗腫瘤活性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。對(duì)適宜發(fā)芽富硒的糙米品種篩選及其培養(yǎng)條件優(yōu)化、硒元素與發(fā)芽糙米生理變化和主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)動(dòng)員的關(guān)系、硒在富硒發(fā)芽糙米部位和蛋白質(zhì)中的分布進(jìn)行了研究,并對(duì)富硒發(fā)芽糙米硒蛋白進(jìn)行了分離純化和鑒定,考察了主要硒蛋白的體外抗氧化和抗腫瘤活性.主要研究結(jié)果如下:
　　 1、在培養(yǎng)液中添加Na2SeO4或Na2SeO3均可顯著提高發(fā)芽糙米對(duì)總硒及蛋白結(jié)合硒

2、的富集,Na2SeO4或Na2SeO3濃度與糙米發(fā)芽率及芽長(zhǎng)密切相關(guān),當(dāng)其添加量小于60μmol/L時(shí),對(duì)發(fā)芽率及芽長(zhǎng)均無顯著影響(P>0.05),濃度繼續(xù)升高則產(chǎn)生顯著抑制作用(P<0.05)；用Na2SeO4和Na2SeO3溶液培養(yǎng)時(shí),發(fā)芽糙米中硒富集量分別呈Michaelis-Menten趨勢(shì)(R2=0.974,P<0.01)和直線趨勢(shì)(R2=0.985,P<0.01)增加,表明發(fā)芽糙米對(duì)Na2SeO4和Na2SeO3具有不同的富

3、集方式與途徑；糙米對(duì)Na2SeO3的富集與轉(zhuǎn)化能力高于Na2SeO4；不同品種糙米對(duì)硒的富集和轉(zhuǎn)化能力差異達(dá)極顯著水平(P<0.01),在10種糙米品種中,Z8和X57具有較強(qiáng)的富硒和轉(zhuǎn)化能力；在培養(yǎng)溫度為20-30℃、培養(yǎng)時(shí)間2-4 d、Na2SeO3濃度30-90μmpl/L范圍內(nèi),采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得最優(yōu)培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度26℃、培養(yǎng)時(shí)間4 d、Na2SeO3濃度52μmol/L,在此條件下所得富硒發(fā)芽糙米中

4、總硒含量為9.19μg/g,蛋白結(jié)合硒比率為54.21％。
　　 2、探討了硒與發(fā)芽糙米生理變化和主要貯藏物質(zhì)動(dòng)員的關(guān)系。硒濃度小于60μmol/L時(shí)對(duì)發(fā)芽糙米呼吸強(qiáng)度無顯著影響；當(dāng)濃度為90μmol/L時(shí),Z8和X57兩種發(fā)芽糙米呼吸強(qiáng)度分別比對(duì)照下降19.7％和22.6％；硒添加量為0-90μmol/L時(shí),對(duì)發(fā)芽糙米干物質(zhì)損失率無顯著影響；高濃度的硒對(duì)糙米生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用,阻礙淀粉的降解,還原糖含量減少。用90μmol/L的

5、硒培養(yǎng)后,Z8和X57中淀粉含量分別比對(duì)照提高9.53％和8.26％,而還原糖含量分別比對(duì)照下降13.47％和19.37％；當(dāng)硒添加濃度在10—60μmol/L范圍內(nèi)時(shí),對(duì)淀粉及還原糖含量均無顯著影響(P>0.05)；發(fā)芽糙米可溶性蛋白質(zhì)含量與硒濃度呈負(fù)相關(guān),90μmol/L的硒對(duì)其產(chǎn)生抑制作用,Z8和X57分別比對(duì)照下降19.38％和16.72％；游離氨基酸含量隨硒濃度的增加呈先增加后下降的趨勢(shì),在10μmol/L具有最大值,Z8和X

6、57分別比對(duì)照提高12.80％和14.82％,而用90μmol/L的硒培養(yǎng)時(shí),游離氨基酸含量分別比對(duì)照下降9.02％和12.72％；發(fā)芽糙米蛋白酶包含多種同工酶,低濃度硒可顯著提高蛋白酶活性,濃度過高對(duì)其產(chǎn)生抑制作用；GSH-Px活性變化規(guī)律與蛋白酶活性變化相同。
　　 3、硒在富硒發(fā)芽糙米組織部位和蛋白質(zhì)組分中的分布呈現(xiàn)不均衡性.發(fā)芽糙米的米芽中硒濃度最高,從外部米糠層向內(nèi)胚乳層呈逐漸遞減規(guī)律；約40-50％的硒分布于占發(fā)芽糙

7、米重量10-15％的米芽、米糠層和外胚乳中；富硒發(fā)芽糙米清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量變化趨勢(shì)與發(fā)芽時(shí)間和硒處理濃度有關(guān)。除醇溶蛋白外,糙米發(fā)芽后各蛋白組分含量均顯著下降,但清蛋白和球蛋白降解先于谷蛋白；當(dāng)硒濃度在0-90μmol/L范圍內(nèi)時(shí),各處理濃度對(duì)發(fā)芽糙米谷蛋白和醇溶蛋白含量均無顯著影響,但低濃度的硒可促進(jìn)發(fā)芽糙米清蛋白和球蛋白的降解；四種蛋白組分中均結(jié)合有不同程度的硒,但各蛋白組分對(duì)硒的富集及轉(zhuǎn)化能力差異顯著,總硒和蛋白

8、結(jié)合硒含量順序?yàn)榍宓鞍?谷蛋白>球蛋白>醇溶蛋白；雖然清蛋白對(duì)總硒及蛋白結(jié)合硒富集量最高,但蛋白結(jié)合硒比率最低,而醇溶蛋白中蛋白結(jié)合硒比率最高；富硒發(fā)芽糙米蛋白分子量主要分布于13.6—121.4 kDa,硒主要結(jié)合于蛋白質(zhì)中,但不同分子量的蛋白質(zhì)結(jié)合硒的數(shù)量與其分子量呈負(fù)相關(guān),其中84.3％的硒結(jié)合于分子量不高于36.3 kDa的蛋白質(zhì)中。
　　 4、采用Sephadex G-100凝膠過濾和DEAE-Sephcrose-FF

9、離子交換層析法對(duì)富硒發(fā)芽糙米硒蛋白進(jìn)行了分離純化,所得蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE檢驗(yàn)為單一條帶,其分子量為14.3—15.2 kDa；對(duì)已純化硒蛋白經(jīng)HPLC測(cè)定其氨基酸組成,結(jié)果顯示各蛋白質(zhì)樣品中谷氨酸含量均為最高,占氨基酸總量的17.97-21.49％,其次為亮氨酸,而半胱氨酸、組氨酸、蛋氨酸含量均在1.5％以下；與蛋白質(zhì)氨基酸相比,硒代氨基酸含量較低,其中SeCys2和SeMet含量分別為0.091—0.012μg/100μg和0.

10、015—0.017μg/100μg,而Se-MSC含量未檢出.經(jīng)MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量圖譜鑒定知,三組蛋白分別為hypothetical protein LOC_Os12g27080、hypothetical protein OsJ_19801和Os01g0348900,其分子量分別為15.11、14.93和15.16 kDa,三種蛋白均來自于水稻粳亞種(Oryza sativa,japonica cultivar-group)

11、,與樣品屬性吻合。
　　 5、研究了富硒發(fā)芽糙米硒蛋白總還原力、清除超氧陰離子、DPPH及羥自由基的能力,以及對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-823和人肝癌細(xì)胞株HePG2的生長(zhǎng)抑制和損傷作用。富硒發(fā)芽糙米硒蛋白F1、F4和F5在超氧陰離子自由基、DPPH自由基及羥自由基體系中均顯示了較強(qiáng)的抗氧化能力,其中F1對(duì)羥自由基清除能力顯著高于F4和F5,而F5對(duì)超氧陰離子自由基,DPPH自由基清除能力最高；各蛋白樣品對(duì)自由基的清除能力表現(xiàn)出劑量