聯(lián)苯菊酯和DDTs對映體選擇性水生毒性、神經(jīng)毒性及相關(guān)機(jī)理研究.pdf

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),世界半數(shù)人口面臨瘧疾威脅。瘧疾危害已成為當(dāng)今發(fā)展中國家最大的死亡原因之一。瘧疾控制中,通過室內(nèi)噴灑殺蟲劑阻斷瘧疾傳染源是減輕人口病因及死因的主要途徑。世界衛(wèi)生組織將十二種殺蟲劑作為室內(nèi)噴灑的主要劑型,其中包括于2001年被禁用的DDT及目前廣泛使用的新型合成菊酯。目前,菊酯類農(nóng)藥由于高效安全,其生成及銷售占據(jù)農(nóng)藥市場較大份額。且菊酯類農(nóng)藥在害蟲防治上的使用量處于上升趨勢,已成為發(fā)達(dá)國家瘧疾控制的主要用藥。然而,瘧疾源

2、對新型殺蟲劑的抗藥性產(chǎn)生,使得DDT相繼被14個發(fā)展中國家重新啟用。
　　 有關(guān)報道顯示,菊酯類農(nóng)藥及DDTs殺蟲劑在瘧疾控制地區(qū)水、土壤、人體及動物體內(nèi)具有較高濃度的殘留。雖然菊酯類農(nóng)藥易降解、對哺乳動物低毒,但水生毒性較大,微量殘留即可對水生生物造成危害。而有關(guān)DDTs的研究僅集中于發(fā)達(dá)國家的低濃度慢性暴露。有關(guān)這兩類農(nóng)藥在瘧疾控制區(qū)的生態(tài)安全及對人類健康風(fēng)險報道甚少。因此,本研究一方面,針對瘧疾控制地區(qū)DDT高暴露水平下相

3、關(guān)對映體選擇性神經(jīng)毒性及有機(jī)氯農(nóng)藥誘導(dǎo)神經(jīng)毒性分子機(jī)理進(jìn)行探討;另一方面對新型菊酯類農(nóng)藥在低濃度下慢性水生毒性的對映體選擇性進(jìn)行研究。因此,本研究一方面,針對瘧疾控制地區(qū)DDT高暴露水平下相關(guān)對映體選擇性神經(jīng)毒性及有機(jī)氯農(nóng)藥誘導(dǎo)神經(jīng)毒性分子機(jī)理進(jìn)行探討;另一方面對新型菊酯類農(nóng)藥在低濃度下慢性水生毒性的對映體選擇性進(jìn)行研究。具體內(nèi)容分述如下:
　　 1)菊酯類農(nóng)藥對水生生物急性毒性很高,且各對映體間差異顯著,一些可達(dá)數(shù)百倍左右。但

4、有關(guān)菊酯農(nóng)藥對映體選擇性水生慢性毒性報道甚少。本研究選擇了代表性菊酯類農(nóng)藥聯(lián)苯菊酯(Bifenthrjn,BF),一方面從對映體水平上對大型蚤21天慢性毒性進(jìn)行研究;另一方面,從蚤體對其選擇性吸收,試圖解釋產(chǎn)生選擇性毒性的可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在大型蚤慢性毒性的眾多毒性終點(diǎn)中,BF對母蚤的存活及繁殖的影響存在顯著的對映體選擇性,并且在第7天及第14天,1R-cis-BF毒性潛能分別是1S-cis-BF的40和80倍。在后7天實(shí)驗(yàn)中,1

5、R-cis-BF毒性與1S-cis-BF間毒性差異有所下降,并觀察到1S-cis-BF組母蚤因未能正常蛻皮而死亡的現(xiàn)象,推測可能原因是由于1S-cis-BF內(nèi)分泌干擾效應(yīng)大于lR-cis-BF。在吸收實(shí)驗(yàn)中,大型蚤對1R-cis-BF的吸收量比1S-cis-BF大14-40倍。因此,推測大型蚤對BF的選擇性吸收,可能是引起1R-cis-BF在急性毒性和慢性毒性上都比1S-cis-BF強(qiáng)的原因之一。以上結(jié)果表明,BF的慢性水生毒性具有明顯

6、的對映體選擇性,且與其在水生生物體內(nèi)的對映體選擇性富集或吸收有關(guān)。
　　 2)基于在瘧疾控制區(qū),由于DDT的使用造成部分人群污染負(fù)荷偏高的特點(diǎn),我們用PC12神經(jīng)細(xì)胞為體外模型,以高通量篩選等生物技術(shù),對DDT高濃度暴露下誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性及可能機(jī)理進(jìn)行了一系列的研究。研究結(jié)果表明,D,p’-DDT在神經(jīng)毒性上表現(xiàn)為對映體選擇性并且:R4(-)-o,p’-DDT＞S-(+)-o,p'-DDT。具體表現(xiàn)為R-(-)-o,p’-DDT通

7、過改變凋亡關(guān)鍵分子p53、Caspase3及NFkB的表達(dá)水平,在誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的潛能上顯著高于S-(+)-o’p’-DDT;同時,R-(-)-D,p’-DDT能更顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷及干擾抗氧化應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)。以上結(jié)果表明-R-(-)-o,p’-DDT對神經(jīng)細(xì)胞的毒性潛能大于S-(+)-o,p’-DDT,且與內(nèi)分泌干擾效應(yīng)選擇性一致。提示在化合物健康風(fēng)險評價中,要進(jìn)行多個毒性終點(diǎn)的整合評價;并且對于高殘留,生物富集大的手性持

8、久性污染物的健康風(fēng)險效應(yīng)的對映體選擇性研究也不容忽視。
　　 3)手性持久性有機(jī)污染物的代謝產(chǎn)物通常也為持久性手性污染物。因此在評價該類化合物安全性時,結(jié)合其代謝產(chǎn)物的風(fēng)險效應(yīng)更能反映實(shí)際情況。本節(jié)選用o,p’-DDT的代謝產(chǎn)物o,p’-DDD為模式化合物,運(yùn)用PC12神經(jīng)細(xì)胞,在上述研究基礎(chǔ)上,通過相關(guān)指標(biāo)檢測,比較了母本化合物與代謝產(chǎn)物的毒性及其相關(guān)對映體選擇性。研究結(jié)果表明,D,P’-DDD在與o,p’-DDT同一數(shù)量級范

9、圍內(nèi)引起神經(jīng)毒性,并且R構(gòu)型對神經(jīng)細(xì)胞毒性大于S構(gòu)型。具體表現(xiàn)為:R-(+)-o,p’-DDD誘導(dǎo)產(chǎn)生較多的MDA,LDH及抑制抗氧化酶活性;擾亂氧化應(yīng)激中相關(guān)基因表達(dá);在凋亡相關(guān)分子中,更大地誘導(dǎo)了p53蛋白表達(dá)。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)顯示,o,p’-DDT代謝并沒有減弱其神經(jīng)毒性作用。而在誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能信號通路上,o,p’-DDD的信號通路較其母本化合物簡單。并且,由于代謝脫氯未能影響原母本化合物的空間結(jié)構(gòu),使得兩者的R構(gòu)型毒性均較S構(gòu)

10、型高,即對映體選擇性表現(xiàn)為一致效應(yīng)。
　　 4)為研究有機(jī)氯化合物DDT神經(jīng)毒性的潛在靶標(biāo)分子。本課題選擇DDT主要代謝產(chǎn)物p,p’-DDE為研究對象,以神經(jīng)細(xì)胞PC12為研究模型。在高通量篩選及驗(yàn)證基礎(chǔ)上預(yù)選出可能的靶標(biāo)分子;進(jìn)一步以RNA干擾構(gòu)建TNFα缺失的PC12細(xì)胞和使用TNFα抑制劑的方法在體外模型中驗(yàn)證篩選的潛在靶標(biāo)分子;最后,以48 h斑馬魚胚胎為體內(nèi)模型進(jìn)一步驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,p,p’-DDE能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)

11、生凋亡,并且在凋亡的相關(guān)基因中,膜外受體TNF家族中較多成員變化顯著。因此選擇其中最為重要的TNFα為可能的靶標(biāo)分子,選擇TNFα單抗類克為抑制劑。結(jié)果顯示,類克對p,p’-DDE誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性,細(xì)胞凋亡及凋亡執(zhí)行分子Caspsae家族相關(guān)成員均有一定程度的緩解及表達(dá)水平下調(diào)。TNFα SiRNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,細(xì)胞內(nèi)TNFα表達(dá)降低,能減少p,p'-DDE對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)。體外實(shí)驗(yàn)說明TNFα在P,P’-DDE誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起著重要

12、作用。同時,斑馬魚胚胎腦部細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,抑制劑對p,p’-DDE弓J起的腦部神經(jīng)細(xì)胞凋亡有所恢復(fù)。表明無論在體內(nèi)還是體外,p,p'-DDE在誘導(dǎo)神經(jīng)毒性中,可能的靶分子之一為膜外受體TNFα。而TNFα抑制劑可能是阻斷有機(jī)氯化合物引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷的候選分子。
　　 目前,對已禁用和現(xiàn)用手性農(nóng)藥的生態(tài)安全和健康風(fēng)險對映體選擇性研究越來越深入,本研究提示對于新型農(nóng)藥的環(huán)境安全和健康風(fēng)險的研究應(yīng)在環(huán)境殘留特征和生物體污染負(fù)荷的對映體