胞外DNA結(jié)合蛋白SAP調(diào)控DNA免疫識(shí)別的機(jī)制極其應(yīng)用研究.pdf

1、DNA作為最重要的遺傳物質(zhì)，一直以來(lái)受到遺傳學(xué)和基因工程研究的關(guān)注。通過(guò)DNA的人工操作和導(dǎo)入進(jìn)行的基因治療和核酸疫苗，也是醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)范疇下的重要研究領(lǐng)域之一。然而，大量前期實(shí)踐證實(shí)，人體的基因治療和核酸疫苗的效果并不理想，并與小鼠等模式生物中的研究結(jié)果差別很大。這部分提示了人體內(nèi)可能存在限制DNA導(dǎo)入和基因治療的某些機(jī)制，從而影響了目前DNA介導(dǎo)的基因治療的發(fā)展。針對(duì)這些抑制性機(jī)制進(jìn)行研究，無(wú)疑對(duì)于基因治療和核酸疫苗的發(fā)展具有重要意義

2、。
　　 近年來(lái)研究表明，DNA也是人體免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除的重要成分。外源性的核酸物質(zhì)，包括感染病原體的核酸組分，人工合成的核酸片段和模擬分子等，還是內(nèi)源性的核酸物質(zhì)，包括人體自身的體液循環(huán)核酸，細(xì)胞凋亡小體內(nèi)的DNA片段等，均可以成為免疫系統(tǒng)的識(shí)別對(duì)象，并引起強(qiáng)烈的先天免疫反應(yīng)和抗原特異性免疫反應(yīng)。在臨床疾病方面，DNA免疫識(shí)別的異常可以引起SLE，干燥綜合癥，銀屑病等多種自身免疫性疾病，而另一方面，DNA作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，

3、在腫瘤，感染性疾病中早有應(yīng)用，而攜帶特定基因的DNA載體，又在DNA疫苗和基因治療領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。因此，研究DNA的免疫識(shí)別機(jī)制，不僅可以對(duì)免疫和炎癥相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制有著更深層次的認(rèn)識(shí)，更可以為DNA佐劑和DNA為基礎(chǔ)的基因疫苗和基因治療研究增加理論基礎(chǔ)，并為其應(yīng)用研究開拓新的方向。
　　 基于以上背景，本論文從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了研究:
　　 第一部分：胞外DNA結(jié)合蛋白SAP對(duì)DNA先天免疫識(shí)別的調(diào)控機(jī)制研究

4、r>　　 我們首先根據(jù)人和小鼠對(duì)DNA反應(yīng)性的顯著物種差別，提出了人體內(nèi)可能特異性存在某些DNA清除及負(fù)向調(diào)控分子的假設(shè)。通過(guò)DNA結(jié)合蛋白質(zhì)免疫沉淀偶聯(lián)質(zhì)譜鑒定的技術(shù)篩選了人和小鼠的差異性DNA結(jié)合蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人血清中主要的DNA結(jié)合蛋白為血清淀粉樣蛋白P物質(zhì)(SAP)，而小鼠中不存在結(jié)合DNA的SAP蛋白。經(jīng)過(guò)采用Dot-EIA和EMSA對(duì)SAP DNA結(jié)合活性的驗(yàn)證，證實(shí)了SAP是主要的物種差異性DNA結(jié)合蛋白。SAP結(jié)合D

5、NA不依賴于DNA大小，構(gòu)象和結(jié)構(gòu)，并且可以被一種SAP抑制劑CHPHC通過(guò)改變其天然五聚體結(jié)構(gòu)而破壞。
　　 我們進(jìn)一步探討了SAP結(jié)合DNA后對(duì)DNA降解，DNA入胞等生理過(guò)程的影響。我們發(fā)現(xiàn)了SAP可以促進(jìn)DNA被人和小鼠巨噬細(xì)胞吞噬,而且這種吞噬的效率很高，吞噬的DNA定位于早期內(nèi)體，但未在晚期內(nèi)體分布，且降解迅速，降解過(guò)程可以被氯喹阻斷，提示DNA吞噬后進(jìn)入早期內(nèi)體，并在內(nèi)體酸化過(guò)程中降解。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DNA在無(wú)SA

6、P存在的情況下，主要是通過(guò)胞巨飲途徑攝取，且依賴分子主要為HMGBl, LL37等，而SAP存在下主要通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞途徑，且主要的依賴受體為Fcγ受體(FcγRs)和清道夫受體。SAP可以對(duì)HMGB1, LL37等分子有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。因此，我們提出了SAP可以改變DNA的攝取途徑和DNA的胞內(nèi)代謝過(guò)程，抑制DNA進(jìn)入胞漿的轉(zhuǎn)染過(guò)程而促進(jìn)其在內(nèi)體中的降解。
　　 隨后，我們探討了SAP介導(dǎo)的DNA入胞對(duì)DNA先天免疫識(shí)別的影

7、響。SAP可以顯著地抑制DNA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞激活，表現(xiàn)為細(xì)胞因子和趨化因子分泌大大減少，而且可以抑制TLR9下游的NF-κB, RIG-Ⅰ、DAI下游的IRF3轉(zhuǎn)錄因子的激活。為了探討SAP的抑制DNA免疫功能在正常生理?xiàng)l件下有無(wú)意義，我們?cè)隗w內(nèi)外模擬正常人生理環(huán)境進(jìn)行研究，采用SAP的抑制劑CHPHC進(jìn)行干預(yù)后以DNA進(jìn)行刺激。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SAP生理?xiàng)l件下可以抑制DNA誘導(dǎo)的免疫激活，而CHPHC處理可以消除SAP的抑制作用，恢復(fù)DNA誘

8、導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)。這充分提示了SAP對(duì)先天免疫反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控作用及其生理意義。
　　 第二部分:SAP對(duì)DNA先天免疫識(shí)別的影響機(jī)制在核酸疫苗和肝臟疾病領(lǐng)域中的應(yīng)用研究
　　 核酸疫苗是重要的新型疫苗，但是其免疫效力在人體實(shí)驗(yàn)中很不理想，且其機(jī)制尚不明確。鑒于SAP的上述對(duì)于SAP與DNA轉(zhuǎn)染和DNA先天免疫激活的關(guān)系，我們?cè)O(shè)想SAP可能是限制核酸疫苗體內(nèi)免疫效力的關(guān)鍵性因素。我們首先通過(guò)疫苗按種組織的病理學(xué)研究證明了S

9、AP在接種肌肉，引流淋巴結(jié)均有分布。在體內(nèi)研究中，我們首先采用了人SAP和DNA的復(fù)合物聯(lián)合注射的策略，驗(yàn)證了SAP對(duì)DNA免疫原性的影響;隨后構(gòu)建了人SAP轉(zhuǎn)基因小鼠模型，進(jìn)一步研究在轉(zhuǎn)基因小鼠上驗(yàn)證了DNA疫苗免疫原性下降的現(xiàn)象。進(jìn)一步采用SAP抑制劑CHPHC作為佐劑，發(fā)現(xiàn)DNA疫苗的免疫原性顯著提高。進(jìn)行綜合上述理論，我們提出了SAP在人類接種核酸疫苗中可能使得部分核酸疫苗被火活，抑制其活性，是一種針對(duì)外源核酸物質(zhì)的防御機(jī)制的假

10、設(shè)。CHPHC作為SAP抑制劑，有可能有力地改善核酸疫苗的免疫效力。
　　 肝臟炎癥和肝癌研究存在著重大的臨床意義。但是肝臟炎癥，肝細(xì)胞再生及肝癌發(fā)生之問(wèn)的相互關(guān)系仍然是撲朔迷離。我們?cè)O(shè)想了細(xì)菌和病毒來(lái)源的DNA可能對(duì)于肝臟內(nèi)的先天免疫激活有著重要意義，研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)存在著DNA的識(shí)別受體RIG-Ⅰ，并且DNA可以跨膜進(jìn)入肝細(xì)胞，激活RIG-Ⅰ下游的IRF3信號(hào)分子。這一攝取過(guò)程也與SAP的存在有關(guān)。這一機(jī)制對(duì)于細(xì)菌成分和DN

11、A病毒引起的肝臟炎癥機(jī)制有著重要的意義。我們還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HBxAg對(duì)SAP介導(dǎo)的DNA識(shí)別具有抑制性作用，并對(duì)HBxAg誘導(dǎo)的基因表達(dá)改變進(jìn)行了系統(tǒng)性分析，這些機(jī)制在肝炎發(fā)生發(fā)展中可能具有重要意義。在肝癌研究中，我們也發(fā)現(xiàn)了SAP在肝癌微環(huán)境中的聚集現(xiàn)象，提示了SAP介導(dǎo)的DNA先天免疫激活對(duì)肝癌和腫瘤炎性微環(huán)境中的可能意義。
　　 總之，本研究從細(xì)胞外的DNA結(jié)合蛋白及DNA誘導(dǎo)的宿主系統(tǒng)性反應(yīng)入手，對(duì)DNA的入胞過(guò)程和先天免

12、疫激活負(fù)向調(diào)控機(jī)制反應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，提出了DNA免疫識(shí)別的pass or arrest假說(shuō)。我們認(rèn)為細(xì)胞外存在著DNA的抑制性調(diào)控分子，并證實(shí)SAP可能是其中的關(guān)鍵成分，并且具有物種差異性。當(dāng)SAP以較高濃度存在于細(xì)胞外環(huán)境時(shí)，DNA被SAP所結(jié)合并抑制其免疫激活屬性，即SAP"arrest"DNA；而當(dāng)某些環(huán)境下HMGB1及LL37等蛋白分泌增多，DNA可以被其攜帶，穿過(guò)即"pass"SAP屏障并進(jìn)一步被先天免疫細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞和