高溫和干旱脅迫下茶樹轉(zhuǎn)錄組分析及Histone H1基因的功能鑒定.pdf

1、茶樹[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]是一種多年生常綠木本植物，在全球范圍內(nèi)廣泛種植，由其葉片加工而成的‘茶’飲品被譽(yù)為“世界三大非酒精飲料”之一。茶樹在其生命周期中經(jīng)常遭受各種環(huán)境脅迫的影響，其中高溫和干旱脅迫是影響茶樹生長發(fā)育、茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，且隨著全球氣候的變暖以及水資源的日益匱乏，高溫和干旱脅迫對(duì)茶樹造成的影響日趨嚴(yán)重。因此，提高茶樹高溫、干旱抗性、選育抗逆性茶樹品種是目前茶樹科研工作者面前

2、艱巨而亟待解決的課題。然而，傳統(tǒng)的茶樹育種方法選育周期漫長且難以控制育種方向以獲得理想表型，使茶樹遺傳改良工作進(jìn)展緩慢。所以，了解茶樹響應(yīng)高溫和干旱脅迫的分子機(jī)制，篩選抗性候選基因，進(jìn)而通過生物技術(shù)手段有針對(duì)性地改善茶樹目的性狀，對(duì)選育茶樹高溫、干旱抗性優(yōu)良品種具有重要意義。
　　針對(duì)上述科學(xué)問題，本論文以茶樹良種‘龍井長葉’為試驗(yàn)材料，利用第二代高通量測(cè)序、生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)手段深入研究了高溫、干旱脅迫下茶樹葉片在轉(zhuǎn)錄

3、水平上的響應(yīng)機(jī)制，干旱脅迫影響茶樹葉片主要生物活性成分積累的分子機(jī)制，以及茶樹Histone H1基因（CsHis-H1）在逆境響應(yīng)中的功能機(jī)制，詳細(xì)的研究內(nèi)容及結(jié)論如下:
　　1.利用RNA-Seq技術(shù)分析比較了正常條件和高溫、干旱脅迫下茶樹葉片的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)情況。結(jié)果顯示，高溫脅迫下大量編碼Ca2+結(jié)合蛋白的基因被下調(diào)表達(dá)，而干旱脅迫處理下相應(yīng)差異表達(dá)基因(DEGs)中上調(diào)表達(dá)的比例較高，尤其是CIPK和CML家族基因，表明Ca2

4、+信號(hào)途徑在茶樹響應(yīng)高溫和干旱脅迫過程中均發(fā)揮重要作用，但其分子調(diào)控機(jī)制存在一定差異。另外，六類主要的逆境響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子(HSF、WRKY、AP2/EREBP、bZIP、NAC、MYB)在茶樹響應(yīng)高溫和干旱脅迫過程中亦存在不同的調(diào)控響應(yīng)模式，其中差異表達(dá)的HSF家族轉(zhuǎn)錄因子在高溫脅迫下幾乎均為上調(diào)表達(dá)，而在干旱脅迫下更多的為下調(diào)表達(dá);差異表達(dá)的WRKY、bZIP、MYB、NAC家族轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫下大量為上調(diào)表達(dá)，而在高溫脅迫下幾乎均為

5、下調(diào)表達(dá)。此外，高溫脅迫下HSPs基因被大量上調(diào)表達(dá)，其主要依賴于HSFs的調(diào)控;干旱脅迫則誘導(dǎo)了大量AQPs基因的表達(dá)，及部分HSPs基因表達(dá);而LEAs蛋白作為植物逆境脅迫中一類重要功能蛋白，高溫干旱脅迫下其編碼的DEGs幾乎均為下調(diào)表達(dá)。
　　2.觀察分析了干旱脅迫對(duì)茶樹表型、生理特性及主要生物活性成分積累的影響，結(jié)果表明干旱脅迫引起茶樹葉片脫水和枯萎，并導(dǎo)致葉片總多酚、游離氨基酸含量顯著下降及總黃酮含量的增加。同時(shí)，HPL

6、C分析表明，干旱脅迫下，茶樹葉片中兒茶素、咖啡堿、茶氨酸和某些游離氨基酸的含量均顯著減少，進(jìn)一步表明干旱脅迫嚴(yán)重影響了茶樹葉片中主要生物活性成分的積累。此外，基于RNA-Seq的分析數(shù)據(jù)，我們獲得了干旱脅迫下茶樹葉片中與氨基酸代謝和次生物質(zhì)代謝相關(guān)的DEGs，特別是與兒茶素、咖啡堿和茶氨酸合成途徑相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因，而且這些關(guān)鍵調(diào)控基因的表達(dá)水平與HPLC分析的結(jié)果相一致，揭示了干旱脅迫影響茶樹葉片中主要生物活性成分積累的分子調(diào)控機(jī)制。

7、
　　3.通過qRT-PCR分析了低溫、高鹽、ABA、干旱和氧化脅迫下茶樹葉片中CsHis-H1基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示CsHis-H1被上述非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，表明其參與了茶樹對(duì)多種非生物脅迫的響應(yīng)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CsHis-H1導(dǎo)入煙草植株中，經(jīng)PCR檢測(cè)扣RT-PCR分析獲得兩個(gè)高表達(dá)量轉(zhuǎn)基因煙草植株。透射電鏡觀察顯示轉(zhuǎn)基因煙草的染色質(zhì)發(fā)生一定程度的凝聚，而這種變化沒有影響轉(zhuǎn)基因煙草正常的生長和發(fā)育，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)