云南小?？Х葷穹òl(fā)酵中微生物的研究.pdf

1、云南小?？Х劝l(fā)酵是典型的濕法發(fā)酵過程，而它優(yōu)良品質(zhì)的形成與發(fā)酵過程中的微生物有著密切關(guān)系。目前國內(nèi)對(duì)云南小?？Х鹊难芯恐煌Ａ粼诳Х确N植資源收集、遺傳育種、咖啡系列產(chǎn)品開發(fā)等領(lǐng)域較多，但在咖啡發(fā)酵領(lǐng)域還未曾研究過。本文對(duì)咖啡發(fā)酵過程中各個(gè)階段進(jìn)行樣品采集，同時(shí)對(duì)發(fā)酵體系中的物理指標(biāo)如溫度、含水量和pH進(jìn)行測(cè)定。并采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法和變性梯度凝膠電泳技術(shù)相結(jié)合對(duì)云南小粒咖啡濕法發(fā)酵過程中的微生物進(jìn)行了菌群結(jié)構(gòu)和演變規(guī)律的分析，鑒定了微生

2、物種類，并確定了優(yōu)勢(shì)菌種。同時(shí)對(duì)發(fā)酵過程中的有機(jī)酸含量和果膠酶的活性進(jìn)行了檢測(cè)，為揭示咖啡發(fā)酵的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，本研究的主要內(nèi)容是:
　　 1、本文對(duì)云南小?？Х劝l(fā)酵過程中各階段的的物理因子進(jìn)行了檢測(cè)，包括溫度、含水量和pH。發(fā)酵堆的上部、中部、下部溫度相差不大，且隨著時(shí)間的推移，發(fā)酵溫度整體變化不大，在20℃左右小幅度波動(dòng)。而pH整體呈下降趨勢(shì)，在發(fā)酵前18h，緩慢下降，發(fā)酵18h至23 h，下降最快，發(fā)酵23 h到36h，又

3、降低緩慢。含水量在發(fā)酵前13h有小幅度上升，13h之后的變化規(guī)律與pH相同。研究結(jié)果表明，測(cè)量的理化影響因子的變化與微生物的變化規(guī)律及咖啡的品質(zhì)有著密切的關(guān)系。
　　 2、在云南小?？Х葷穹òl(fā)酵過程中，采樣階段分為發(fā)酵0h、13h、18h、23 h及36 h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)。分別取發(fā)酵堆的上層樣、中層樣、下層樣和混合樣（上層、中層和下層的混合樣）。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)采用了七種不同的培養(yǎng)基（YEPD、LB、查氏、MRS、EMB、DG18、

4、WL），以及不同的濃度梯度(10-3、104、10-5)，在20℃的條件下對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)、計(jì)數(shù)、分離、純化和鑒定。并對(duì)所有鑒定純化后的微生物進(jìn)行保存。對(duì)分離得到的所有的微生物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序及鑒定菌種類型的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量的產(chǎn)果膠酶的微生物。發(fā)酵初期以細(xì)菌占主要優(yōu)勢(shì)。鑒定的細(xì)菌主要有腸桿菌屬、芽胞菌屬、假單胞菌屬、泛菌屬;其次是葡糖桿菌屬、克呂沃爾菌屬、還有耶爾森氏菌屬和沙雷氏菌屬;鑒定的絲狀真菌主要包括枝狀枝孢菌、總狀毛霉等。

5、隨著發(fā)酵的進(jìn)行，細(xì)菌和真菌的總量在逐漸減少，而酵母的總量卻在增加。鑒定的酵母的種類主要有畢赤酵母菌屬;其次是孢漢遜酵母屬、假絲酵母菌屬、紅酵母菌屬。
　　 3、本研究對(duì)典型的四種產(chǎn)果膠酶的菌種:畢赤克魯維酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母、枯草芽胞桿菌及產(chǎn)氣腸桿菌的產(chǎn)果膠酶進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在培養(yǎng)條件與發(fā)酵體系保持一致的條件下進(jìn)行，結(jié)果表明四種菌株都能產(chǎn)生清晰的透明圈，即產(chǎn)生了果膠酶。
　　 4、采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)小粒咖啡發(fā)

6、酵過程中的樣品勻漿液直接提取全DNA，然后進(jìn)行DNA的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，最后對(duì)細(xì)菌、酵母、真菌進(jìn)行變形梯度凝膠電泳，從而確定了發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌種，并對(duì)微生物的菌落結(jié)構(gòu)和演變規(guī)律進(jìn)行了分析。其中細(xì)菌以Halospirulina sp、變形菌門、腸桿菌科細(xì)菌、水生拉恩氏菌、蠟樣芽孢桿菌和成團(tuán)泛菌為優(yōu)勢(shì)菌種;酵母以畢赤克魯維酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母、Gibberella stilboides和乳源酵母為優(yōu)勢(shì)菌種。
　　 5、本文應(yīng)用DNS法

7、對(duì)云南小?？Х劝l(fā)酵中果膠酶活性進(jìn)行了測(cè)定。在發(fā)酵初期果膠酶活性為211 u，隨著發(fā)酵的進(jìn)行酶活是逐漸增加的，發(fā)酵18h時(shí)達(dá)到最大值，酶活在740 u左右，之后逐漸減小。果膠酶活性的變化規(guī)律與產(chǎn)果膠酶的優(yōu)勢(shì)菌種的變化規(guī)律保持一致。
　　 6、本研究應(yīng)用高效液相色譜法對(duì)發(fā)酵過程中的咖啡樣品中的八種有機(jī)酸進(jìn)行含量的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)，草酸、乙酸、乳酸含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行是逐漸增加的。在發(fā)酵18h到23 h是增長速度最快，2