硫化氫及相關酶活性的雙光子熒光探針設計與成像分析.pdf

1、硫化氫(H2S)作為一種重要的氣體遞質分子，在生命活動中扮演著無可取代的角色。生物體內的H2S主要由胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)催化底物L-半胱氨酸產生，當CBS/CSE的活性發(fā)生改變，會嚴重影響H2S的生理濃度，進而誘發(fā)各類疾病。因此，精確掌握H2S的含量變化以及引起H2S濃度改變的生理機制顯得愈發(fā)重要。這不僅要求研究者準確追蹤H2S生理濃度的變化，而且對引起H2S濃度改變的CBS/CSE活性的實時監(jiān)測，

2、成為了科學工作者亟需解決的科學難題。
　　化學工作者近年來發(fā)展了一大批熒光分子探針用于監(jiān)測生物體內H2S的濃度變化，但大多數(shù)H2S探針是基于單光子檢測手段，對復雜生物體內H2S的研究還存在一些困難。雖然一些已報道的H2S雙光子探針能夠很好地應用于生物體內的成像分析，但是大部分H2S探針的響應時間需要30 min以上，不利于體內快速代謝的H2S的檢測。另外，由于H2S的濃度與CBS/CSE的活性具有明顯的相關性，發(fā)展檢測CBS/CS

3、E的活性探針對進一步了解H2S的生理機制具有重要的價值。但是，目前檢測CBS/CSE的方法主要集中在同位素標記法、比色法以及分光光度法，但是，這些方法存在一些固有缺陷，比如操作繁瑣、程序復雜以及靈敏度低等，而且僅適用于體外檢測，無法實現(xiàn)實時、無損、原位分析。因此，尋找一種能實現(xiàn)對生物體內CBS/CSE活性實時、無損檢測的手段是非常重要的。
　　針對H2S的研究現(xiàn)狀，且基于雙光子熒光成像具有分辨率高、組織穿透性好等優(yōu)勢，本文具體開展

4、了以下兩個工作:
　　(1)基于香豆素衍生物較強的雙光子吸收面積，本工作發(fā)展了一種新型的雙光子熒光探針TPP-H2S。為了提高TPP-H2S與H2S的反應速率，引入了NBD-C1基團。NBD-C1具有很強的拉電子效應，使得連接基團O帶部分正電荷，這為H2S的進攻，提供了一個良好的親核位點。利用H2S較強的親核能力，TPP-H2S與H2S能夠快速地發(fā)生親核取代反應，整個反應過程僅需2 min左右。此外，NBD-C1與香豆素存在較好的

5、分子內電荷轉移效應，TPP-H2S的熒光被淬滅，當醚鍵被H2S切斷，羥基被釋放出來，香豆素的熒光得以恢復。進一步細胞實驗表明，TPP-H2S具有很好的細胞穿透能力以及被成功的應用于細胞及細胞內快速代謝的H2S的監(jiān)測，而且通過活體解剖術，TPP-H2S首次實現(xiàn)了對小鼠不同組織內源性H2S含量的分析。
　　(2)基于氯代香豆素-部花青染料，本工作設計了一種新型的、能夠同時響應H2S和Cys的雙光子熒光探針，實現(xiàn)對CBS/CSE活性的成

6、像分析。為了區(qū)分H2S和Cys的熒光發(fā)射光譜，結合H2S與Cys的分子特點，設計了氯代香豆素和雙鍵兩個反應位點。探針與H2S和Cys反應時，反應第一階段，前者形成巰基香豆素-部花青，后者因親核基團-NH2的存在，在親核取代過程中發(fā)生分子內重排反應形成氨基香豆素-部花青。隨后，兩者中間產物發(fā)生巰基與雙鍵的分子內成環(huán)反應，前者形成六元環(huán)，后者則形成七元環(huán)，造成產物的π電子結構不同，兩者的熒光發(fā)射光譜區(qū)分開。由于生物體內Cys在CBS/CSE

7、的催化作用下可以轉化為H2S，因此可以通過檢測H2S和Cys濃度的改變，表現(xiàn)為雙光子熒光信號強度的相對變化，實現(xiàn)對細胞內CBS/CSE活性的成像分析。
　　通過以上兩個工作，本文初步實現(xiàn)了對H2S濃度的快速檢測以及不同小鼠組織內的含量分析，更重要的是，實現(xiàn)了對能夠改變H2S生理濃度的CBS/CSE活性的成像分析?；诖耍狙芯科谕谌祟悓2S生理濃度的檢測及引起H2S濃度改變的深層生理機制提供潛在價值，為全方位掌控H2S的動態(tài)變