組氨酸標簽蛋白純化介質(zhì)的合成及其應用研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的分離純化是發(fā)展蛋白組學和進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究與應用的前提和基礎(chǔ)。固定化金屬螯合親和層析（IMAC）利用配體和組氨酸標簽蛋白的特異親和性，是一種靈敏有效的蛋白分離純化技術(shù)。離子液體作為一種綠色溶劑，由于陽離子與陰離子都具有可設(shè)計性以及對生物活性分子的化學穩(wěn)定性，被應用在蛋白質(zhì)分子的保存以及分離純化等方面，而近期對離子液體功能化的研究更是為在離子液體綠色溶劑中發(fā)揮官能團的特殊功能提供了思路。本課題將IMAC技術(shù)和功能化離子液體結(jié)合

2、起來，即合成一種金屬離子配合作用較強的氮雜大環(huán)(TACN)，并將這種對組氨酸殘基有特異親和性的配體鏈接到一種疏水性離子液體上，形成一種親和性離子液體-離子液體支載TACN的金屬螯合物，來和蛋白水溶液液液萃取來一步分離純化組氨酸標簽蛋白，并對這種親和性離子液體的重復利用能力以及回收再生方法進行探究。主要研究內(nèi)容如下:
　　(1)以氯丁腈為原料，同氯化氫反應后經(jīng)關(guān)環(huán)得到雙環(huán)瞇唑，再與過量的1，6-二溴己烷反應合成烷基雙環(huán)咪唑陽離子的離

3、子液體;以乙二醇、二乙酰胺為原料磺?；蠼?jīng)關(guān)環(huán)、甲基化以及脫除對甲苯磺?；炔襟E來合成功能性配體氮雜大環(huán)TACN;將TACN連接到烷基雙環(huán)咪唑陽離子上，進行陰離子交換使其具有疏水性能，和金屬離子螯合后就形成親和性離子液體AIL。以甲基咪唑和氯丁烷為原料親和加成，疏水性陰離子交換合成萃取溶劑離子液體(IL):[Bdmim][NTf2]。NMR、MS、HRMS對重要產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)和純度鑒定。
　　(2)以組氨酸標簽綠色熒光蛋白(His-

4、tagged EGFP)為對象來探究IL，AIL/IL，M2+-AIL/IL(M=Cu、Ni、Zn)三種體系對His-tagged EGFP的親和性能，并通過熒光強度分析不同體系對蛋白活性的影響。結(jié)果表明只有完整的M2+-AIL/IL對目標蛋白具有親和能力，而且螯合三種金屬離子的體系所親和的EGFP都不同程度地保持了熒光特性。
　　(3)研究了不同離子強度下M2+-AIL/IL(M=Cu、Ni、Zn)對His-taggedEGFP

5、親和性能的影響。結(jié)果表明:Zn2+-AIL/IL和Ni2+-AIL/IL隨著離子強度的增大對目標蛋白的親和能力也提高，而Cu2+-AIL/IL呈現(xiàn)先降低后增長的趨勢。說明離子強度可以改變蛋白質(zhì)分子表面的疏水基團的數(shù)量以及和親和介質(zhì)之間的靜電強度等因素來影響M2+-AIL/IL對組氨酸標簽蛋白的親和能力。同時還以定量的His-tagged EGFP為對象，選取梯度含量的M2+-AIL/IL進行親和試驗，通過親和目標蛋白的量來判斷出對于定量

6、目標蛋白最適宜的M2+-AIL/IL的用量，以便節(jié)約成本和發(fā)揮親和介質(zhì)的最大功效。
　　(4)選定最適宜的離子強度和M2+-AIL/IL的含量，將M2+-AIL/IL應用于從大腸桿菌細胞裂解物中一步純化目標蛋白His-tagged EGFP。結(jié)果表明:Cu2+-AIL/IL對His-tagged EGFP的親和能力最強，但純化后的純度較低;Ni2+-AIL/IL的親和能力最弱;純化效果最佳的體系為Zn2+-AIL/IL，純化效率約

7、為50％，目標蛋白純度約為90％，并對該體系純化過程中各組分進行紫外光譜分析。還將Zn2+-AIL/IL應用到了從大腸桿菌表達的粗蛋白中提純組氨酸標簽的青霉素結(jié)合蛋白，獲得了純度高達約95％的目標蛋白。
　　(5)離子液體的的重復利用能力以及可回收再生的特性是其獨特的優(yōu)勢，通過M2+-AIL/IL連續(xù)親和His-tagged EGFP的過程中親和性能的變化來探究M2+-AIL/IL的重復利用能力，通過EDTA反復解吸螯合在配體上的