結(jié)直腸癌抗原特異性T細胞擴增與制備的關(guān)鍵技術(shù)研究.pdf

1、目的:結(jié)直腸癌(CRC)在我國的發(fā)病率和致死率呈不斷上升趨勢。包括免疫治療在內(nèi)的綜合治療在結(jié)直腸癌治療中起到越來越重要的作用。通過多種方式用腫瘤抗原刺激自體淋巴細胞獲得抗原特異性殺傷細胞的研究眾多，腫瘤細胞表面的抗原被抗原提呈細胞(APC)加工成抗原肽與主要組織相容復合物(MHC)分子形成復合物提呈給T細胞并誘導其活化，形成腫瘤抗原特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。轉(zhuǎn)化生長因子βⅡ型受體（TGFβRⅡ）和O位N-乙酰葡萄糖胺糖基轉(zhuǎn)移

2、酶(OGT)基因的框移突變產(chǎn)生的兩種新生抗原具有HLA-A2限制性，存在于20-40％的HLA-A2限制性結(jié)直腸癌患者且不存在于正常人和其他腫瘤患者，提呈后的抗原肽分別為TGFβRⅡ（RLSSCVPVA，131-139）和OGT（SLYKFSPFPL，28-37）。腫瘤為了逃避識別，下調(diào)甚至不表達MHC分子，部分腫瘤患者免疫細胞數(shù)下降功能低下都會造成腫瘤抗原無法提呈，導致T細胞無法活化。針對上述T細胞無法活化的現(xiàn)狀，我們?nèi)斯ず铣煽乖牟?/p>

3、與患者的外周血T細胞共培養(yǎng)，以提高結(jié)腸癌特異性T細胞的活化效率。接下來，用樹突狀細胞(DC)結(jié)合抗原肽誘導活化殺傷性T細胞與抗原肽直接刺激活化細胞比較殺傷效能，以期獲得同等或者更好的殺傷效果且減少體外對細胞操作，降低副反應(yīng)發(fā)生率。綜上所述，本課題旨在構(gòu)建簡便有效的腫瘤特異性T細胞的制備方法，以達到增強特異性同時降低更加安全的目的。
　　方法:合成TGFβRⅡ(RLSSCVPVA，131-139)和OGT（SLYKFSPFPL，28

4、-37）兩段抗原肽，質(zhì)譜分析進行純度鑒定;篩選獲得表達TGFβRⅡ(RLSSCVPVA，131-139)和OGT(SLYKFSPFPL，28-37)且具有HLA-A2限制性的結(jié)腸癌細胞系一株:DLD-1。選擇具有HLA-A2限制性的結(jié)直腸癌患者，應(yīng)用密度梯度離心法和細胞因子刺激方式分離外周血培養(yǎng)獲得結(jié)直腸癌患者CD8+T細胞為主的外周血單個核細胞(PBMC)混懸液，流式細胞分析鑒定刺激培養(yǎng)前后細胞表型及比例;使用抗原肽與CD8+T細胞共

5、培養(yǎng)刺激活化產(chǎn)生抗原特異性CTL，MTS實驗測定針對DLD-1結(jié)腸癌細胞系不同效靶比的殺傷效應(yīng)，ELISA方法評估了各組IFN分泌情況以進一步評估CTL活化和殺傷能力。
　　其次，表達HLA-A2分子健康人的PBMC誘導獲到成熟DC附載抗原肽刺激相應(yīng)個體T細胞活化形成抗原特異性CTL，比較DC疫苗誘導的CTL與直接使用抗原肽刺激的CTL殺傷活性。
　　結(jié)果:我們獲得的TGFβRⅡ(RLSSCVPVA，131-139)和OGT

6、（SLYKFSPFPL，28-37）抗原肽，純度≥99％，分別加入到表達HLAA2分子的結(jié)直腸癌患者和健康人PBMC，DC進而誘導形成的抗原肽特異性CTL，經(jīng)MTS試驗證實經(jīng)抗原肽刺激2的結(jié)直腸癌患者T細胞混懸液在第殺傷實驗3天效靶比為5/1，10/1，20/1分別獲得對DLD-1的48.54％，63.62％和70.23％殺傷率，低于健康對照組的殺傷率為66.32％，74.82％和81.61％，僅在10/1條件下無抗原肽處理患者組的殺傷

7、能力優(yōu)于健康對照，說明抗原肽刺激無法提高結(jié)腸癌患者自體免疫細胞殺傷DLD-1的能力。另外，與DC細胞負載抗原肽誘導形成的腫瘤抗原肽特異性CTL相比，直接使用抗原肽刺激正常人的T細胞為主的PBMC誘導得到的特異性CTL能夠?qū)LD-1獲得更好的殺傷效果:與DC負載抗原肽誘導形成的腫瘤抗原肽特異性CTL相比，直接刺激獲得的特異性CTL第14天在效靶比為5/1時，DC負載抗原肽1(OGT)與抗原肽1直接刺激獲得的CTL對DLD-1的殺傷率分別

8、為26.71％和65.84％(P=0.054)，DC負載與抗原肽2（TGFβRⅡ）直接刺激的CTL對DLD-1的殺傷率分別為20.69％和81.32％(P=0.039)，DC負載與抗原肽1+2直接刺激的CTL對DLD-1的殺傷率分別為39.91％和69.24％(P=0.048)。在效靶比為10/1時，DC負載與抗原肽直接刺激的CTL對DLD-1的殺傷率分別為36.33％和88.82％(P=0.038)，DC負載與抗原肽2直接刺激的CTL