酶法交聯(lián)結(jié)合熱處理對(duì)青蟹精氨酸激酶致敏性的影響.pdf

1、蟹類作為一種營(yíng)養(yǎng)豐富，肉質(zhì)鮮美的優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品，廣受大家喜歡，隨之而來(lái)引發(fā)的食物過(guò)敏病例也是逐年增多，嚴(yán)重的影響了人們的生活質(zhì)量，因此對(duì)過(guò)敏原的消減已經(jīng)成為熱門研究方向。酶法交聯(lián)因?yàn)榭梢愿纳频鞍踪|(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)，被廣泛應(yīng)用于食品加工中，近期有研究表明其對(duì)過(guò)敏原致敏性也有一定的影響，但對(duì)甲殼類過(guò)敏原致敏性的影響并無(wú)報(bào)道。本文以精氨酸激酶（ariginine kinase, AK）為試驗(yàn)對(duì)象，研究酶法交聯(lián)結(jié)合熱處理對(duì)AK致敏性的影響，并深入探究其

2、交聯(lián)位點(diǎn)，闡明致敏性改變的原因，為開發(fā)低致敏性產(chǎn)品提供理論依據(jù)。
　　本研究首先從擬穴青蟹中純化得到天然 AK，從大腸桿菌體外表達(dá)獲得重組 AK（recombinant ariginine kinase, rAK），對(duì)兩者的差異進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，rAK與AK在消化穩(wěn)定性和免疫結(jié)合活性方面沒(méi)有差別；在結(jié)構(gòu)方面，rAK游離巰基含量和疏水性高于AK，蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)折疊松散，導(dǎo)致其熱穩(wěn)定性下降。
　　為了研究酶法交聯(lián)在消減AK

3、致敏性方面的作用，首先對(duì)用于交聯(lián)的酶進(jìn)行了篩選，結(jié)果顯示，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶與辣根過(guò)氧化物酶均不能有效促進(jìn)AK交聯(lián)。酪氨酸酶可促進(jìn)AK交聯(lián)，其反應(yīng)條件為 AK經(jīng)45℃熱處理30 min后，在1600 U/mL酪氨酸酶和0.06μmo l/mL咖啡酸的作用下反應(yīng)8 h。
　　在建立的酶法交聯(lián)結(jié)合熱處理?xiàng)l件下，采用蛋白組學(xué)和免疫組學(xué)方法分析AK的交聯(lián)程度、消化穩(wěn)定性、交聯(lián)產(chǎn)物（cross-linked thermal polymerize

4、d ariginine kinase, CL-pAK）的免疫結(jié)合活性，又進(jìn)一步通過(guò)建立RBL-2H3細(xì)胞模型和BALB/c小鼠過(guò)敏模型評(píng)價(jià)其致敏性。電泳及電鏡結(jié)果顯示，在咖啡酸和酪氨酸酶催化下AK能夠有效交聯(lián)，產(chǎn)生大分子物質(zhì)。AK發(fā)生交聯(lián)后更耐胃蛋白酶消化，且消化產(chǎn)物IgG/IgE結(jié)合活性降低。抑制性ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，AK交聯(lián)后的半抑制濃度由1.13μg/mL升高至228.36μg/mL。BALB/c小鼠過(guò)敏模型結(jié)果顯示，CL-p