煙曲霉Z5不同內(nèi)切木聚糖酶與乙酰木聚糖酯酶的異源表達(dá)及協(xié)同作用研究.pdf

1、全世界每年會(huì)產(chǎn)生大約2000億噸的農(nóng)業(yè)廢棄物，是自然界最廣泛的木質(zhì)纖維素來源之一，包括農(nóng)作物秸稈、稻殼、甘蔗渣、玉米芯等。木質(zhì)纖維素主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，木聚糖是半纖維素中最豐富的一類。目前，對于半纖維素酶的生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究也主要集中在木聚糖降解酶。木聚糖酶是水解木聚糖為木糖的一類降解酶，由于其可降解木聚糖中的β-1，4糖苷鍵，既可降低木聚糖的粘性和抗?fàn)I養(yǎng)性，又可產(chǎn)生具有保健和調(diào)節(jié)胃腸功能的低聚木糖，已廣泛應(yīng)用于食品

2、、飼料、醫(yī)藥、造紙、紡織等行業(yè)。木聚糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性決定了其降解需要多種木聚糖酶的協(xié)同作用，包括水解主鏈的內(nèi)切木聚糖酶、木糖苷酶以及水解側(cè)鏈的一些酯酶等。由于天然木質(zhì)纖維素底物的復(fù)雜性，這些木聚糖降解酶系之間如何通過協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)木聚糖的完全水解，其中的機(jī)理目前尚不清楚。
　　實(shí)驗(yàn)室從高溫堆肥樣品中篩選得到一株高效纖維素降解真菌A.fumigatus Z5，以木聚糖為唯一碳源進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵，通過RT-PCR、質(zhì)譜分析等獲得了幾個(gè)主要的木

3、聚糖降解相關(guān)基因，包括4個(gè)內(nèi)切木聚糖酶基因(Y699_04481，06333，07611，09486)，2個(gè)木聚糖苷酶基因(Y699_04570，05610)和1個(gè)乙酰木聚糖酯酶基因(Y699_05457)。本研究旨在實(shí)現(xiàn)這些木聚糖酶基因在黑曲霉AB1.13和畢赤酵母X33中的高效異源表達(dá)，同時(shí)對Afumigatus Z5中不同內(nèi)切木聚糖酶和乙酰木聚糖酯酶在木聚糖降解中的協(xié)同作用進(jìn)行研究，主要研究結(jié)果如下:
　　(1)對木聚糖酶基

4、因絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建過程中表達(dá)載體的構(gòu)建、原生質(zhì)體的制備以及轉(zhuǎn)化效率的提高進(jìn)行了初步探索，獲得了黑曲霉原生質(zhì)體的制備條件:菌絲體培養(yǎng)24 h，使用復(fù)配酶(蝸牛酶(100 mg/mL)+溶壁酶(100U/mL))酶解2～2.5 h。
　　(2)在畢赤酵母X33內(nèi)成功地表達(dá)了來源于A.fumigatus Z5的一個(gè)GH10家族的β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶基因Y699_09486和一個(gè)具有碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列(cbm_1)的乙酰木聚

5、糖酯酶基因Y699_05457，對應(yīng)的表達(dá)蛋白分別命名為Xyn10C和AXE1。Xyn10C轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液酶活為83.08IU/mL，最適反應(yīng)條件為70℃，pH5.0-6.0，60℃處理1h后酶活仍保持在95％以上。乙酰木聚糖酯酶AXE1轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液酶活達(dá)到84.76IU/mL，最適反應(yīng)條件為55-60℃，pH7.0-7.5，60℃處理1h后酶活保持在70％以上。
　　(3)將來源于A.fumigatus Z5的一個(gè)GH10家族的多

6、結(jié)構(gòu)域內(nèi)切木聚糖酶基因Y699_04481的cbm_1序列及其多絲氨酸連接序列(linker)連接在另一個(gè)GH10家族的單結(jié)構(gòu)域β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶基因Y699_06333（對應(yīng)的異源表達(dá)蛋白為Xyn10B）的C端，并在畢赤酵母X33內(nèi)成功地進(jìn)行了融合表達(dá)。比較了Xyn10B和融合蛋白Xyn10BaLC的酶學(xué)性質(zhì)差異，同時(shí)對Xyn10BaLC的CBM功能進(jìn)行測定。結(jié)果表明，CBM的存在不會(huì)影響Xyn10B的酶學(xué)性質(zhì)，但是Xyn10B

7、aLC對燕麥木聚糖的催化效率(Kcat/Km)明顯降低，由Xyn10B的22.42 s-1 mg-1 ml-1降低至4.57 s-1mg-1 ml-1。
　　(4)研究了不同的內(nèi)切木聚糖酶Xyn10C、Xyn10B和Xyn10BaLC對水洗玉米芯粉末(the washed corncob powder，WCCP)以及經(jīng)高溫高壓處理的WCCP的降解效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同屬于GH10家族的單結(jié)構(gòu)域內(nèi)切木聚糖酶Xyn10C和Xyn10B，對

8、于水洗玉米芯粉末(WCCP)幾乎無降解產(chǎn)還原糖能力，而帶有CBM的Xyn10BaLC則能夠降解WCCP產(chǎn)還原糖;對于經(jīng)高溫高壓處理后的WCCP，Xyn10BaLC降解產(chǎn)還原糖量增加，Xyn10C和Xyn10B也表現(xiàn)出了降解產(chǎn)還原糖能力，且Xyn10B較Xyn10C能夠產(chǎn)生更多的還原糖。從上述降解效果來看，CBM的存在使得內(nèi)切木聚糖酶具備了降解天然不可溶木聚糖底物的能力，而底物的預(yù)處理會(huì)破壞不可溶木聚糖底物的結(jié)構(gòu)，從而使不攜帶CBM的內(nèi)切

9、木聚糖酶表現(xiàn)出降解能力，由此推測，同屬于GH10家族且都為單結(jié)構(gòu)域酶的內(nèi)切木聚糖酶Xyn10C和Xyn10B，在催化效率上會(huì)存在有不同的差異，這可能是燕麥木聚糖誘導(dǎo)的A.fumigatus Z5中Xyn10C和Xyn10B對應(yīng)的基因都有高轉(zhuǎn)錄但是質(zhì)譜分析卻檢測不到Xyn10C的原因。
　　(5)研究了不同的內(nèi)切木聚糖酶Xyn10C、Xyn10B和Xyn10BaLC和乙酰木聚糖酯酶AXE1對水洗玉米芯粉末(WCCP)的協(xié)同降解效果，

10、結(jié)果只有Xyn10BaLC和AXE1表現(xiàn)出了對WCCP的協(xié)同效應(yīng)。這可能是由于Xyn10BaLC和AXE1兩個(gè)酶均有CBM_1的存在，從而會(huì)引導(dǎo)它們趨向玉米芯中同一區(qū)域的木聚糖底物，因此表現(xiàn)出協(xié)同降解效果，即存在“協(xié)同效應(yīng)區(qū)域化”。這一結(jié)果說明，對于復(fù)雜的天然固體木聚糖底物，CBM的存在，除了在內(nèi)切木聚糖酶降解不可溶木聚糖底物過程中有很重要的作用，在內(nèi)切木聚糖酶和乙酰木聚糖酯酶的協(xié)同作用中同樣占有至關(guān)重要的地位。
　　(6)研究了

11、玉米芯水洗程度及機(jī)械粉碎程度對于木聚糖酶降解效果的影響。分別以水洗玉米芯粉末(WCCP)和未水洗玉米芯粉末以及不同顆粒大小的玉米芯作底物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，類似于經(jīng)高溫高壓預(yù)處理的玉米芯，內(nèi)切木聚糖酶Xyn10B、Xyn10BaLC、Xyn10C均能夠降解未水洗的玉米芯粉末產(chǎn)還原糖，但是Xyn10BaLC與AXE1則不再表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng);此外，無論是水洗還是未水洗，玉米芯顆粒越小，酶解產(chǎn)生的還原糖總量越多。Xyn10B、Xyn10C能夠降解未水洗

12、的玉米芯產(chǎn)還原糖，可能的原因是未水洗的玉米芯表面有足夠多的可溶性的、易接觸的木聚糖，這些木聚糖底物可被Xyn10B、Xyn10C直接作用，因此表現(xiàn)出了降解能力;同樣的，Xyn10BaLC的催化中心也會(huì)作用于這些可溶性的、易接觸的木聚糖，這樣就降低了Xyn10BaLC和AXE1通過CBM_1與纖維素的結(jié)合對同一特定區(qū)域木聚糖底物的導(dǎo)向性，因此協(xié)同效率降低。不同的內(nèi)切木聚糖酶通過作用于玉米芯不同區(qū)域的木聚糖共同發(fā)揮水解作用，可能是A.fum