基于酶擴增合成銅納米顆粒及其在生物傳感上的應(yīng)用.pdf

1、納米技術(shù)的提出為納米材料科學(xué)的發(fā)展及應(yīng)用開辟了新的領(lǐng)域?，F(xiàn)代科學(xué)研究中，納米技術(shù)結(jié)合物理、化學(xué)、生物和醫(yī)學(xué)成像和超靈敏檢測的方法在分析化學(xué)和生命科學(xué)中的地位越來越重要，是一個極具前景的領(lǐng)域。由于粒徑微?。?-100 nm）,金屬納米材料在化學(xué)、物理和電子性質(zhì)非常獨特，可用作構(gòu)建新型的傳感設(shè)備，特別在生化傳感和電化學(xué)傳感等方面。金屬納米材料的運用可以降低檢測限，提高傳感器的靈敏性，開拓一些已有材料不能完成的新的工作。
　　近年來，以

2、DNA為模板來合成銅納米顆粒（DNA-CuNPs）在生物成像及傳感應(yīng)用中引起了越來越多研究者的廣泛關(guān)注。因為其具有細(xì)微的尺寸，低毒性和很好的生物相容性的優(yōu)勢，相比于現(xiàn)已存在的熒光金屬納米粒子，以 DNA為模板合成的銅納米顆粒是一種新型的功能化生物化學(xué)探針。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT），是一種特別的DNA聚合酶，它通過在DNA引物的3′-OH端不斷添加堿基，催化無模板的DNA發(fā)生聚合反應(yīng)。TdT廣泛用作分子生物工具，用來標(biāo)記DNA末端。

3、本文基于TdT的擴增反應(yīng)，提出了一種合成DNA-CuNPs的新型方法，并應(yīng)用于酶的活性檢測和分析。具體如下：
　　1、利用TdT催化單鏈 DNA（ssDNA）聚合反應(yīng)的性質(zhì)，開發(fā)出了一種新型的DNA-CuNPs合成方法。在一條原本不能合成CuNPs的DNA3′-OH端通過TdT催化發(fā)生聚合反應(yīng)，從而在該DNA引物3′-OH端不斷添加堿基，得到一段聚合胸腺嘧啶（polyT）的DNA序列，然后以這段 polyT為模板合成能夠發(fā)射熒光的

4、DNA-CuNPs。此外，我們優(yōu)化了TdT擴增反應(yīng)的條件，以及可能會影響合成DNA-CuNPs的因素。并且比較分別以 DNA-P-polyT和T40為 DNA模板合成DNA-CuNPs，發(fā)現(xiàn)以DNA-P-polyT為模板合成的DNA-CuNPs發(fā)射出更高的熒光強度。同時，我們通過透射電子顯微鏡（TEM）來表征DNA-CuNPs。根據(jù)TEM圖，我們分析以長鏈為模板合成的DNA-CuNPs熒光強度更大的原因是：1)長鏈DNA序列可以移除Cu

5、NPs表面極性溶劑，從而更好的保護CuNPs；2)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的現(xiàn)象可能存在于CuNPs之間。
　　2、基于新型 DNA-CuNPs合成方法的構(gòu)建，我們提出了一種 TdT的活性分析檢測方法。該方法實現(xiàn)了對TdT進行無標(biāo)記、低背景、高靈敏地“turn-on”酶活分析，檢測限為3.75 U/mL。此外，該方法具有較穩(wěn)定的重復(fù)性，在復(fù)雜生物環(huán)境中的添加回收取得了較滿意的結(jié)果。接著，我們考察了TdT抑制劑焦磷酸鈉對TdT的

6、抑制效果。
　　3、基于TdT對隨機DNA底物擴增及新型DNA-CuNPs的合成，我們構(gòu)建了一個酶活檢測的通用性平臺。我們選取限制性內(nèi)切酶（BamHI）和堿性磷酸酶(ALP)作為目標(biāo)分析物。實驗得到，BamHI的檢測限為0.005 U/mL，信背比為31.4，跟相關(guān)文獻報道的相仿；ALP的檢測限為0.052×10-3U/mL，信背比為44.6，比相關(guān)文獻報道較低。由于酶對底物具有特異性，所以BamHI和ALP的選擇性都很好。此外，

7、只需要換成不同的酶對應(yīng)的DNA底物，就可以應(yīng)用于核酸外切酶、切刻內(nèi)切酶、DNA連接酶的活性分析。
　　4、基于核酸內(nèi)切酶V(EndonucleaseV)可以識別并切割脫氨基損傷以及切刻內(nèi)切酶Nt.BbvCI特異性識別并切割含有其識別序列的DNA，我們把前面提出的新型DNA-CuNPs合成方法用于Endonuclease V的“turn-on”放大檢測。通過合理地設(shè)計三條 DNA探針─一條含脫氧次黃嘌呤核苷的探針(Sub-DNA），