油茶種仁糖酵解途徑解析及醛縮酶基因家族功能研究.pdf

1、油茶是我國特色油料樹種，主要栽培分布于南方丘陵酸性紅壤地區(qū)。茶油因其品質優(yōu)良而受到國家的高度重視。但是單位面積產量低一直是制約油茶產業(yè)快速發(fā)展的主要因素。油茶常規(guī)育種周期長，常規(guī)雜交育種可能伴有遺傳累贅。采用分子設計育種新方法改良油茶，可實現(xiàn)單一性狀或多個性狀的定向改良，大大縮短育種周期，而且不會帶有遺傳累贅。糖酵解代謝途徑是油茶種仁油脂合成的上游代謝途徑，其代謝速率直接影響油茶種子油脂合成的效率。果糖1，6-二磷酸醛縮酶不僅是糖酵解代

2、謝途徑中的樞紐調控酶，也是油茶種子油脂合成的樞紐調控酶，還可以調控油茶的生殖生長。本文以國審油茶品種‘華碩’種仁為材料，通過構建數(shù)字化轉錄組和表達譜數(shù)據(jù)庫，系統(tǒng)解析了油茶種仁糖酵解途徑及其與油茶油脂合成和生殖生長的關系;克隆了4個油茶果糖1，6-二磷酸醛縮酶(CoFBA)家族基因;開展了該酶的亞細胞定位研究;分析了該基因表達與油茶種仁含油率等的關聯(lián)性;構建了過表達載體和RNA干擾載體，轉化野生型擬南芥和油菜，獲得了T0代和T1代轉基因植

3、株。這些實驗結果為油茶分子設計育種技術的開發(fā)應用奠定了一定的科學和技術基礎。主要研究結果如下:
　　 1.油茶種仁糖酵解途徑的分子生物學解析。以果實膨大期（6月）和油脂合成高峰期（10月）的油茶種仁為材料，建立了油茶種仁2個時期的合并轉錄組和2個不同時期數(shù)字化表達譜數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)分析顯示，油茶種仁糖酵解途徑主要包含306條Unigene，分別歸屬于23類酶基因，即磷酸葡萄糖變位酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡糖磷酸異構酶、N-乙酰氨基葡

4、萄糖-6-磷酸-異構酶、二磷酸酯酶、磷酸果糖激酶、醛縮酶、丙糖磷酸異構酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、二磷酸甘油酸變位酶、醛鐵氧還蛋白還原酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脫氫酶（硫辛酰胺）、二氫硫辛酸乙酰轉移酶、二氫硫辛酸脫氫酶、丙酮酸脫羧酶、L-乳酸脫氫酶、醛脫氫酶、乙醇脫氫酶、甲醇脫氫酶（細胞色素c）和乙醇脫氫酶（細胞色素c）。這些酶基因大部分為基因家族，其所包含的不同Unigene在油茶種仁發(fā)

5、育的不同時期存在差異表達。油茶種仁表達譜糖酵解途徑Pathway顯著性富集分析結果顯示:該代謝途徑調控基因表達整體上調，由初期始樣本表達量26（6月）上調至高峰期樣本表達量336（10月）。根據(jù)油茶種仁轉錄組糖酵解/異生代謝途徑Unigene數(shù)據(jù)分析和不同時期油茶種仁糖酵解代謝功能基因表達差異分析，總結繪制了油茶種仁糖酵解代謝調控途徑。在分析過程中發(fā)現(xiàn)，轉錄組數(shù)據(jù)庫中有11條CoFBAUnigene序列，其中有2條在油脂合成高峰期原始表

6、達量是果實膨大期原始表達量的3-4倍，明顯高于糖酵解途徑中其他調控酶基因的表達量和變化幅度;油茶FBA從甘油代謝途徑和脂肪代謝途徑直接影響油茶種仁的油脂合成，是影響油茶油脂合成的關鍵酶之一。
　　 2.油茶FBA家族基因克隆及生物信息學分析。根據(jù)轉錄組分析數(shù)據(jù)，分別設計特異引物，采用RACE技術，逐一克隆了4個油茶FBA基因的全長cDNA序列，并在NCBI中注冊，GenBank登錄號分別為JN017093.1、JX914588、

7、JX914589和JX914590。將該4個基因分別命名為CoFBA1、CoFBA2、CoFBA3和CoFBA4。生物信息學方法分析表明，這4個CoFBA基因均無信號肽，為親水性蛋白，含有典型的1，6-二磷酸果糖醛縮酶活性結構，其中CoFBA1、CoFBA3和CoFBA4存在“VMFEGILLKPS”特異結構域，CoFBA2存在“VLLEGTLLKPN”特異結構域;CoFBA蛋白家族分為A、B兩個亞族，CoFBA2歸為B亞族，而CoFB

8、A1、CoFBA3和CoFBA4歸為A亞族，這意味著分化的先后多少與其活性位點、結構以及功能的差異是密切相關的。空間結構預測CoFBA1和CoFBA4與巴貝斯分枝桿菌1，6-二磷酸醛縮酶3kx6A結構相似，而CoFBA2和CoFBA3分別與兔肌肉醛縮酶31geB和惡性瘧原蟲二磷酸醛縮酶2pc4C結構相似。
　　 3.油茶FBA蛋白亞細胞定位研究。采用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞法進行亞細胞定位分析，發(fā)現(xiàn)CoFBA并不單單定位于細胞質。

9、結果顯示，CoFBA1可能定位于細胞核，CoFBA2可能定位于細胞質，CoFBA3可能定位于周質，CoFBA4可能定位于細胞外，這些結果與生物信息學預測的外膜、細胞質、周質和外膜稍有差別。但無論是預測信息還是實驗結果，都體現(xiàn)出CoFBA表達部位的多樣性，而預測顯示這4個醛縮酶均為非分泌性蛋白，如何轉運到胞外，可能與其含有的肉豆蔻酰基化及糖基化位點有關。
　　 4.油茶FBA基因的表達對油茶種仁含油率的影響。油茶果實和種仁的表型特

10、征能體現(xiàn)種仁含油率的差異，果實膨大期之前種皮乳白色，種仁白色，此時含油率僅10％左右，果實近成熟期種皮黑褐色，種仁油黃色，此時含油率升至50％左右。采用實時熒光定量PCR分析了8個不同發(fā)育時期油茶種仁中CoFBA1、CoFBA2、CoFBA3和CoFBA4相對表達量，并對照比較了脂肪酸合成關鍵酶基因CoACP、CoSAD和CoFAD2相對表達量，結合不同發(fā)育時期油茶種仁含油率的變化，采用灰色關聯(lián)分析法，揭示其綜合關聯(lián)度分別為CoFBA1

11、(0.762817)、CoFBA2(0.649344)、CoFBA3(0.672756)、CoFBA4(0.646704)，這與脂肪酸代謝關鍵酶基因的綜合關聯(lián)度CoACP(0.673442)、CoSAD(0.699459)、CoFAD2(0.653404)相比差異不大，說明油茶種仁油脂合成不僅與脂肪酸代謝途徑中各關鍵酶基因相關，而且糖酵解途徑中關鍵酶基因也起到等同甚至更重要的影響。CoFBA基因家族表達調控對油茶種仁含油率具有一定的影響

12、，通過調控CoFBA的表達在一定程度上有可能提高油茶的種仁含油率。
　　 5.超量表達載體和RNA干擾載體構建及遺傳轉化研究。構建了CoFBA1、CoFBA2、CoFBA3和CoFBA4的過表達載體，CoFBA家族共抑制RNA干擾Gateway載體和對照用AtFBA家族RNA干擾Gateway載體，農桿菌介導轉化哥倫比亞野生型擬南芥，篩選獲得了T1代轉基因擬南芥;采用Gateway技術構建CoFBA1過表達載體，農桿菌介導轉化甘