基于夾心免疫法的大腸桿菌電化學傳感器研究.pdf

1、微生物污染引起的食源性疾病已成為世界公共健康的一個主要問題。據(jù)美國疾病控制和預(yù)防中心估計，在美國，每年有7600萬人感染食源性疾病。在所有的病原體微生物中，大腸桿菌是最危險的病原體微生物之一，它可能會導致出血性結(jié)腸炎癥如出血性腹瀉、溶血性尿毒綜合征和血栓性血小板減少性紫癜的發(fā)生。因此，迫切需要開發(fā)簡單、快速且成本低的方法用于高靈敏高特異性的檢測大腸桿菌。
　　本研究開發(fā)了三種類型的生物傳感器用于大腸桿菌的高靈敏高選擇性檢測，傳感器

2、分別基于的放大方式是復合材料、滾環(huán)擴增(RCA)和銀納米(AgNCs)線。這些傳感器都表現(xiàn)出較低的檢出限和較寬的線性范圍，他們也表現(xiàn)出其他優(yōu)點，如選擇性高，重復性好，穩(wěn)定性好。此外，這些生物傳感器已成功地應(yīng)用于大腸桿菌的實際樣品的定量檢測。具體研究內(nèi)容如下：
　　構(gòu)建了一種基于免疫傳感技術(shù)的高靈敏高選擇性的檢測大腸桿菌O157:H7的新型電化學傳感器，該電化學傳感器將捕獲抗體修飾于SG-PEDOT-AuNPs復合物修飾的玻碳電極上

3、，在目標物即大腸桿菌O157:H7的存在下，可通過特異性識別將HRP標記的抗體捕獲于電極表面形成一個夾心型的結(jié)構(gòu)，最后HRP還原電解液中的H2O2產(chǎn)生電化學信號實現(xiàn)大腸桿菌O157:H7的檢測。實驗中，本研究利用了磺化石墨烯和納米金的特有性能，不僅能促進電極表面的電子傳遞還能作為一個能結(jié)合大量抗體的支撐材料，這些都大大提高了傳感器結(jié)合抗體的效率并提高了傳感器的靈敏度。標準曲線結(jié)果顯示該傳感器的檢測范圍是7.8×10-7.8×106 cf

4、u mL-1，檢出限是3.4×10 cfu mL-1。另外，該傳感器成功應(yīng)用于實際樣品（礦泉水和牛奶）的檢測。
　　在該工作中，基于滾環(huán)擴增(RCA)耦合過氧化氫模擬DNA酶放大技術(shù)，本研究構(gòu)建了一個簡單無標記、成本低的電化學生物傳感器用于高靈敏和高選擇性的檢測大腸桿菌。適配體-引物探針(APP)由大腸桿菌適配體和引物序列組成，其中引物與環(huán)狀探針部分互補，環(huán)狀探針包括兩個G-四聯(lián)體的互補序列，APP用于識別目標和引發(fā)RCA擴增延伸

5、。基于RCA耦合酶的擴增策略，目標物大腸桿菌引發(fā)形成無數(shù)的G-四聯(lián)體的重復序列，它在血紅素和鉀離子的存在下折疊成G-四聯(lián)體/血紅素復合物，從而對H2O2產(chǎn)生極強的催化活性并產(chǎn)生顯著的電化學信號。據(jù)我們所知，這項工作是第一次基于RCA耦合過氧化氫模擬DNA酶放大技術(shù)用于電化學分析檢測致病菌。在最佳條件下，所提出的生物傳感器具有超高的檢測范圍跨越5個數(shù)量級和極低的檢測限8 cfu mL-1。此外，本研究的生物傳感器也顯示對大腸桿菌具有高選擇

6、性，并具有快速、成本低、無需電化學標記步驟，簡化操作并避免試劑不穩(wěn)定的優(yōu)點。因此，基于滾環(huán)擴增(RCA)耦合過氧化氫模擬DNA酶放大技術(shù)用于檢測大腸桿菌的電化學方法很有潛力用于實際中相關(guān)食品安全分析和臨床診斷。
　　在該項工作中，一個基于銀納米簇(AgNCs)納米線的簡單，無標記，低成本電化學生物傳感器被開發(fā)用于高靈敏度和高擇性的檢測大腸桿菌。為了制備AgNCs納米線，本研究利用滾環(huán)擴增(RCA)合成重復DNA序列用于AgNCs的

7、組裝。RCA反應(yīng)，可實現(xiàn)成千上萬倍的信號放大。功能寡核苷酸探針(FOP)，含有合成AgNCs的模板序列和可以和RCA產(chǎn)物特異性結(jié)合的序列，AgNCs作為一種金屬模擬酶，有較強的催化H2O2還原的功能。結(jié)合RCA擴增策略，AgNCs結(jié)合到電極的量顯著提高，從而具有極強的雙氧水催化活性，因而放大了信號響應(yīng)強度。由于AgNCs納米線較強的放大效率，構(gòu)建的生物傳感器表現(xiàn)出較寬的線性范圍4.7×10-4.7×106 cfu mL-1和超高靈敏度，