菲降解細(xì)菌在植物根表的成膜作用及其對(duì)植物吸收菲的影響.pdf

1、土壤是人類賴以生存和發(fā)展的基礎(chǔ)！當(dāng)前，我國土壤有機(jī)污染狀況嚴(yán)峻。多環(huán)芳烴(PAHs)是土壤中一類常見的有機(jī)污染物，其疏水性強(qiáng)、難降解、易在土壤中積累。土壤中PAHs可被植物吸收，并通過食物鏈的傳遞嚴(yán)重危害動(dòng)物與人群健康。隨著社會(huì)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品安全問題的日益關(guān)注，如何規(guī)避污染區(qū)農(nóng)產(chǎn)品PAHs污染已成為環(huán)境領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。植物根表存在的細(xì)菌生物膜具有促進(jìn)作物增產(chǎn)、提高植物抗逆性等功能;然而，能否利用植物根表細(xì)菌生物膜來調(diào)控植物吸收PAHs，進(jìn)

2、而防治土壤PAHs污染、降低農(nóng)作物PAHs污染風(fēng)險(xiǎn)？國內(nèi)外對(duì)此至今仍少有了解。
　　本論文從采自PAHs污染場(chǎng)地的健康植物根表分離篩選了2株可高效降解菲的功能菌株RS1和RS2，研究了環(huán)境條件對(duì)菌株降解菲的影響，分析了菌株降解PAHs的廣譜性及對(duì)抗生素的抗性;探討了野生功能菌株的成膜能力及綠色熒光蛋白（gfp）基因標(biāo)記菌株的降解性能和成膜能力;通過溫室盆栽試驗(yàn)，進(jìn)一步研究了gfp標(biāo)記的功能菌株RS2(即45-RS2)根表定殖成膜對(duì)

3、紫花苜蓿生長的影響，初步探討了菌株45-RS2在根表的定殖成膜作用對(duì)紫花苜蓿吸收菲的影響及機(jī)理。主要研究成果如下:
　　(1)從采自PAHs污染場(chǎng)地的健康植株（小飛蓬、車前草、蛤蟆草）根表分離篩選得到2株可高效降解菲的功能細(xì)菌RS1和RS2。經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rRNA基因序列同源性分析，確定菌株RS1和RS2均為Sphingobium sp.細(xì)菌。功能菌株RS1和RS2能以菲為唯一碳源和能源生長，能夠在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下高效降

4、解菲。以5％接菌量(OD600 nm=0.3)接種功能菌株RS1和RS2至PMM(100 mg·L-1)培養(yǎng)基，在30℃、150 r·min-1恒溫?fù)u床培養(yǎng)72 h，對(duì)菲的降解率分別達(dá)到88.9％和98.3％，菌株的菌體數(shù)量最大值分別達(dá)到9.53和10.05 log cfu·mL-1。環(huán)境條件對(duì)菌株降解菲效率的影響表明:菌株RS1降解菲的最適溫度為30℃，適宜pH值范圍為5.0～7.0;菌株RS2的最適溫度為37℃，適宜pH值范圍為5.

5、0～7.0。在供試條件下，底物菲濃度(50～250 mg·L-1)越高，菌株RS1和RS2對(duì)菲的降解率越低;接種量(1～15％)越大，菌株RS1和RS2對(duì)菲的降解率越高。功能菌株RS1和RS2能以苊、蒽、芘和苯并[a]芘等其他單一PAH為唯一碳源和能源生長。相同培養(yǎng)時(shí)間，菌株RS1對(duì)單一PAH蒽、芘和苯并[a]芘的降解率均低于RS2，對(duì)苊的降解率比RS2高。菌株RS1和RS2對(duì)8種抗生素的抗性差異不大，均可在含有氨芐青霉素(200 mg

6、· L-1)、卡那霉素(25 mg·L-1)、鏈霉素(200mg· L-1)和低濃度氯霉素(10 mg·L-1)的培養(yǎng)基中生長;此外，菌株RS1和RS2對(duì)紅霉素的抗性有微小差異，菌株RS2(100mg·L-1)對(duì)紅霉素的抗性比RS1(75 mg·L-1)強(qiáng)。
　　(2)明確了功能菌株RS1和RS2的成膜能力，并對(duì)菌株RS2進(jìn)行了gfp基因標(biāo)記。以pBBRGFP-45為供體質(zhì)粒，pRK2013為輔助質(zhì)粒，菌株RS1和菌株RS2分別為

7、受體質(zhì)粒，通過三親接合方式，成功將gfp基因?qū)肽繕?biāo)菌株體內(nèi)，并命名為45-RS1和45-RS2。通過在30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，菌株RS1和RS2均能在微型離心管中形成生物膜。菲降解能力和細(xì)菌成膜能力的驗(yàn)證結(jié)果表明，gfp基因沒有明顯干擾菌株45-RS2對(duì)菲的降解能力和成膜能力。分別以5％接菌量(OD600 nm=1.0)接種功能菌株RS2和45-RS2至PMM(100mg·L-1)培養(yǎng)基，在30℃、150 r·min-1恒溫?fù)u床培

8、養(yǎng)72 h，對(duì)菲的降解率均達(dá)到99.2％，菌株的菌體數(shù)量分別達(dá)到最大值8.67和9.62log cfu·mL-1。通過溫室盆栽試驗(yàn)，證實(shí)菌株45-RS2能有效地定殖到紫花苜蓿根表形成細(xì)菌生物膜。
　　(3)功能菌株45-RS2在紫花苜蓿根表的定殖和成膜作用可顯著降低植物體內(nèi)的菲濃度以及菲在植物體內(nèi)的積累。通過灌根或浸種處理，菌株45-RS2均能良好地定殖在紫花苗蓿的根表，并形成細(xì)菌生物膜;同時(shí)，部分菌株可進(jìn)入植物根部，并隨蒸騰流遷

9、移到莖葉部。功能菌株45-RS2在植物根表的定殖能促進(jìn)紫花苜蓿的生長，且有效降低了紫花苜蓿根部的菲含量，說明功能菌株45-RS2在植物根表的定殖和成膜作用能促進(jìn)紫花苜蓿根部菲的代謝同時(shí)降低了菲在宿主植物體內(nèi)的積累。
　　(4)功能菌株45-RS2在紫花苜蓿根表的定殖可以影響植物體內(nèi)PAHs代謝相關(guān)酶系活性。在不接菌對(duì)照組中，菲脅迫使紫花苜蓿根部過氧化物酶(POD)活性增強(qiáng)，多酚氧化酶(PPO)活性下降，而過氧化氫酶(CAT)活性變