KLF1突變的人群遺傳學研究及對β地中海貧血臨床表型嚴重性的遺傳修飾作用.pdf

1、背景與目的:
　　本次研究首次通過分子篩查一個大樣本中國人群來調(diào)查KLF1基因的突變率與突變譜，并通過表型研究來評估KLF1突變是否對β地貧具有遺傳修飾作用。
　　設計與方法:
　　一、研究人群、病人和表型檢測
　　本研究通過隨機抽樣對長期居住在中國南方地區(qū)的3918例非親緣關系個體進行了突變分析，這個大人群隊列包括:3839例連續(xù)采集的樣本和79例表型導向型樣本（Hb A2水平:3.3％-4.1％和/或Hb F

2、水平大于1.5％）。與此同時，我們通過采集攜帶KLF1突變的β地貧患者進行了家系研究，以確認突變是自發(fā)突變還是遺傳性突變。另外，我們還召集了中國非地貧高發(fā)區(qū)域的1190例個體作為對照研究，他們來自中國北方地區(qū)山東省。
　　所有的血液學參數(shù)均用自動血細胞計數(shù)儀測定，血紅蛋白組分分析運用高效液相色譜法進行測定。紅細胞表面抗原CD44表達量運用流式細胞儀分析。
　　二、分子遺傳檢測
　　DNA提取采用傳統(tǒng)的酚/氯仿抽提法。通

3、過高分辨率熔解曲線技術分析（HRM assay）篩查所有參加者的KLF1變異，運用第一代測序對所篩查的變異進行驗證。對于KLF1變異是否是功能性突變主要基于兩點標準:(1)根據(jù)表型的變化:攜帶者Hb F水平大于1％同時/或紅細胞表面抗原CD44表達下降;(2)生物信息學預測:應用 SIFT(http://sift.jcvi.org)和 PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)軟件來

4、預測所發(fā)現(xiàn)的KLF1變異是否影響其蛋白質結構和功能。
　　三、統(tǒng)計分析
　　所有的統(tǒng)計分析均使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件或R語言進行，P＜0.05視為具有顯著的統(tǒng)計學差異。
　　結果:
　　一、中國南方地區(qū)人群具有相對高的KLF1突變率
　　中國南方人群KLF1突變率在隊列A，隊列B，隊列C的突變率分別是:1.27％(25/1971)，1.16％(11/946)，1.30％(12/922)，且這三組之間沒有

5、統(tǒng)計學差異，P=0.959，但南方人群KLF1總突變率顯著高于北方人群(1.25％ vs.0.08％，P＜0.001)，說明KLF1突變在中國南方人群有相對高的突變頻率，且在地中海貧血流行區(qū)域更為常見。
　　二、廣泛的KLF1突變譜
　　3839例連續(xù)采集的南方人群樣本（隊列A，B，C）中共鑒定出48個突變的KLF1等位基因，79例表型導向型樣本共發(fā)現(xiàn)16個，檢出率為20.25％。從突變譜看，p.Gly176AlafsX17

6、9和p.His299Asp為最主要的兩種突變，占所有突變的90.6％。另外本研究還報道了13種新的中性KLF1變異，包括4種錯義突變、4種同義突變和5種3'UTR突變。所發(fā)現(xiàn)的這些突變首次展現(xiàn)了KLF1基因人群廣泛的突變譜。
　　三、KLF1突變可改變正常個體血液學參數(shù)
　　通過對41例攜帶KLF1突變的非地貧人群（25例來自隊列A，16例來自隊列D）進行血液學分析，發(fā)現(xiàn)無論是平均紅細胞體積(Mean corpuscular

7、 volume，MCV)還是平均紅細胞血紅蛋白量（Mean corpuscular hemoglobin，MCH）與1946例未攜帶KLF1突變的非地貧人群相比都輕微的降低了(MCV:82.45±5.39 vs.89.29±4.77 fL,P＜0.001; MCH:26.95±2.11 vs.29.46±1.44 pg,P＜0.001)。另外，這41例個體的Hb A2和Hb F水平也有一定程度的升高，分別為3.28±0.45％和3.44

8、±1.75％。因此，本研究首次通過人群研究發(fā)現(xiàn)輕微升高或者處于臨界值的MCV和MCH是KLF1基因突變的重要表型，與升高的Hb A2和Hb F這兩個已發(fā)現(xiàn)的指標一樣，可以提高篩查KLF1基因突變的陽性率。
　　四、KLF1突變可改變β地貧攜帶者的血液學表型
　　本研究對14例KLF1雜合突變與β0雜合突變共遺傳的個體進行了血液學分析，其中7例β0/βN來自隊列B（隊列B中1例β+/βN，1例βE/βN，2例β0/βN合并α地

9、貧被排除分析），另外7例β0/βN來自家系樣本。意外的是，這14例個體MCV或MCH與217例β0雜合突變攜帶者相比，并未顯得更低，無統(tǒng)計學差異(MCV:63.53±3.94 vs.65.11±4.34 fL，P=0.112; MCH:20.26±1.42 vs.20.34±1.37 pg，P=0.567)。另外一方面，這14例個體顯示出了相當高的Hb A2(α262)水平（6.47±0.81％，最低5.10％，最高8.00％），顯示出

10、KLF1突變和β-globin基因突變對δ-globin基因表達升高的疊加作用;與此同時，我們注意到這些樣本具有升高的且變異的Hb F水平（7.67±4.11％，最低3.60％，最高18.20％），但其變異性有待進一步研究。
　　五、KLF1突變可減輕β地貧患者臨床表型嚴重性
　　為了評價KLF1突變對β地貧患者臨床表型的修飾作用，我們?nèi)嫜芯苛?22例β地貧患者的臨床表型和目前已知的潛在的減輕β地貧患者臨床表型的遺傳因素。

11、我們意外的發(fā)現(xiàn)2種KLF1突變選擇性的出現(xiàn)在12例中間型β地貧患者(TI)中（其中10例攜帶p.Gly176AlafsX179，2例攜帶p.His299Asp）。通過Cox比例風險回歸模型(Cox proportional hazards model)對8個潛在修飾因素進行評估結果顯示，KLF1基因突變對β地貧患者臨床表型修飾作用最大(HR=0.213，P＜0.001)，其次是HBB基因型(β+，HR=0.353，P＜0.001)，Xm

12、nI(+，HR=0.512，P＜0.001)，HBA突變（HR=0.671，P＜0.001），rs9399137(HR=0.724，P＜0.001) rs766432（HR=0.761，P＜0.001），但性別因素(HR=0.893，P=0.107)和rs11886868（HR=0.871，P=0.415）這2個因素被模型排除。12例TI的基因型中7例是β0/β0+αα/αα，3例β0/β++αα/αα，2例β0/β0+—SEA/αα，

13、我們通過單因素分析[β0/β0，αα/αα，XmnI(-/-)，rs766432(AA or AC)，rs9399137(TT or CT)]比較7例攜帶KLF1突變和362例無KLF1突變的β地貧患者臨床表型，結果顯示這7例β地貧患者表現(xiàn)出相對輕的臨床表型:較高的Hb水平(82.57±7.81 vs.66.33±17.53 g/L，P=0.006)，較高的Hb F水平（39.58±21.80 vs.9.17土11.05 g/L，P＜0

14、.001），相對少的輸血次數(shù)（OR=0.082，P=0.007）和較低的TM風險率(OR=0.009，P＜0.001)。Kaplan-Meier無輸血生存曲線顯示出顯著的差異存在這兩組中（P＜0.001），其第一次輸血的中位時間分別是36個月和6個月。另外，所有攜帶12例KLF1突變的TI第一次輸血的中位時間是48個月，而922例β地貧患者人群中的342例非攜帶KLF1突變的TI第一次輸血的中位時間是24個月，但統(tǒng)計學并未顯示出兩者間具

15、有差異(P=0.093)，顯示出兩組TI具有一定的同質性。
　　結論:
　　一、本研究首次設計人群遺傳學大樣本的研究調(diào)查出KLF1基因突變在中國南方和中國北方地區(qū)的人群突變率，證明KLF1基因突變在地中海貧血流行區(qū)域更常見(1.25％ vs.0.08％)。與此同時，鑒定出的64個KLF1突變?nèi)娴恼宫F(xiàn)出中國人群廣泛的KLF1突變譜。
　　二、首次通過對攜帶KLF1突變的非地貧樣本和β雜合子樣本的基因型與表型樣的分析，系

16、統(tǒng)闡明了KLF1突變可以引起MCV和MCH輕微降低或處于臨界值，Hb A2水平和HbF水平升高;功能性突變可以使紅細胞表面抗原CD44表達降低。這些變異的表型有助于KLF1突變的人群篩查。
　　三、應用Cox比例風險回歸模型全面系統(tǒng)的評估了包括KLF1突變在內(nèi)的8個因素對922例β地貧患者的臨床表型修飾作用，發(fā)現(xiàn)KLF1突變可以減輕β地貧患者的臨床表型且影響作用最強，對精確診斷β地貧、產(chǎn)前診斷、遺傳咨詢和基因診斷方面提供了重要依據(jù)