新型細(xì)胞膜色譜的建立及黃連黃精配伍藥效物質(zhì)的初步研究.pdf

1、目的：優(yōu)化細(xì)胞膜色譜柱的制備條件，建立新型細(xì)胞膜色譜模型。以細(xì)胞膜色譜為工具考察中藥黃連、黃精配伍中具有改善胰島素抵抗作用的成分，確定黃連黃精配伍的藥效物質(zhì)。
　　方法：1、探討黃連、黃精及其二者配伍的降血糖活性。2、考察離體細(xì)胞膜的保存方法，選用BCA蛋白濃度測(cè)定法考察細(xì)胞膜在固定相磁性微球表面的最適吸附平衡量以及吸附平衡時(shí)間，進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞膜色譜的制備條件。3、建立胰島細(xì)胞膜磁性微球-離線UPLC模型、HepG2細(xì)胞萃取-離線

2、UPLC模型以及3T3-L1脂肪細(xì)胞萃取-離線HPLC模型，并采用上述色譜模型分析中藥黃連、黃精中具有改善胰島素抵抗作用的藥效物質(zhì)。4、通過(guò)胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證細(xì)胞膜色譜模型篩選得到的化合物的活性。
　　結(jié)果：1、中藥黃連、黃精提取液的藥理結(jié)果表明，黃連組、黃精組與模型組比較均可增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用率（P<0.01）；黃連組及黃精組的細(xì)胞上清中的游離脂肪酸濃度均明顯降低，與

3、模型組比較存在顯著性差異（P<0.01）。2、穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，0.9％ NaCl，1% BSA組成的穩(wěn)定劑在0-9 h內(nèi)可延緩細(xì)胞膜表面ATP酶活性的衰減，這保證了細(xì)胞膜受體與活性物質(zhì)結(jié)合、發(fā)揮分離作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。3、通過(guò)細(xì)胞膜與磁性微球吸附量以及吸附時(shí)間的考察，得知細(xì)胞膜初始蛋白濃度為1.2 mg/mL，制備時(shí)間為6 h。4、通過(guò)將胰島細(xì)胞膜與毛細(xì)管結(jié)合制備細(xì)胞膜毛細(xì)管色譜模型，該模型可減少靶細(xì)胞膜的用量，同時(shí)將細(xì)胞膜與磁性微球結(jié)合制

4、備胰島細(xì)胞膜磁性微球-離線色譜模型，用于“垂釣”中藥黃連、黃精中的降血糖活性物質(zhì)。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)方法相比，將細(xì)胞膜固定于磁性微球表面“垂釣”中藥中活性物質(zhì)，結(jié)合色譜質(zhì)譜分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法，無(wú)需填充色譜柱，平衡色譜體系，簡(jiǎn)化了分析過(guò)程。本文采用該法鑒定了黃連中小檗堿等5個(gè)化合物，黃精中6,8-二甲基-4',5,7-三羥基高異黃烷酮等4個(gè)化合物。5、鑒于有些活性物質(zhì)通過(guò)與細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)生相互作用，本文建立了胰島素抵抗3T3-L1細(xì)胞萃取-

5、離線HPLC模型和胰島素抵抗HepG2細(xì)胞萃取-離線UPLC模型。中藥提取液與細(xì)胞共同孵育，得到細(xì)胞內(nèi)容物，借助于UPLC、HPLC、HPLC-MS等色譜手段，分析活性物質(zhì)。采用HepG2細(xì)胞萃取-離線UPLC法從黃連中分離得到小檗堿等5種生物堿；采用3T3-L1細(xì)胞萃取-離線HPLC法分離、鑒定結(jié)果：黃連中分離得到藥根堿等5種化合物，黃精中分離得到6,8-二甲基-4',5,7-三羥基高異黃烷酮等4種化合物，黃連黃精配伍組中分離得到小檗

6、堿等8種化合物；在葡糖糖消耗實(shí)驗(yàn)顯示了它們與模型組有顯著性差異（P<0.05），結(jié)果表明這些物質(zhì)可改善胰島素抵抗。
　　結(jié)論：本文所建立的3T3-L1脂肪細(xì)胞萃取色譜、HepG2細(xì)胞萃取色譜以及胰島細(xì)胞膜磁性微球色譜等新型細(xì)胞膜色譜可用于中藥藥效物質(zhì)的研究。通過(guò)上述方法對(duì)黃連、黃精及其二者配伍的初步研究表明黃連中含有的小檗堿等異喹啉型生物堿以及黃精中含有的高異黃酮類成分具有一定的改善胰島素抵抗活性。因分離得到的化合物結(jié)構(gòu)類型不同，