基于納米材料再造心肌組織生物學(xué)評價與心梗治療研究.pdf

1、心肌組織工程為缺血性心臟疾病治療提供了新的治療策略。研究人員目前在體外已成功構(gòu)建了具有節(jié)律性收縮的再造心肌組織或工程化心肌組織(Engineered cardiac tissues, ECTs)，在體內(nèi)心梗修復(fù)方面也取得顯著成效。然而，考慮到心肌組織本身的電生理特性，以往用于心肌組織構(gòu)建的支架材料難以為心肌細(xì)胞提供導(dǎo)電微環(huán)境，所構(gòu)建的ECTs仍缺乏天然心肌的收縮-興奮耦聯(lián)與電傳導(dǎo)特性。近年來，導(dǎo)電納米材料在電傳導(dǎo)特性的組織構(gòu)建研究中受到

2、研究人員的高度關(guān)注，其中石墨烯已被證實在生物醫(yī)學(xué)尤其是組織工程研究中具有良好的應(yīng)用前景。此外，ECTs的體內(nèi)示蹤對于評價其對心梗治療效果及細(xì)胞行為至關(guān)重要。在諸多標(biāo)記手段中，氧化鐵納米粒(Iron Oxide Nanoparticles, IRONs)因其良好的生物相容性及易檢測等優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于體內(nèi)細(xì)胞移植及ECTs的示蹤中。但針對 IRONs對心肌細(xì)胞微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞活性影響，尤其是三維ECTs中閏盤的形成影響尚不明確。
　　為此，

3、本論文重點闡明IRONs對心肌細(xì)胞微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞活性的影響，尤其是三維ECTs中閏盤形成的影響規(guī)律，并以氧化石墨烯(Graphene Oxide, GO)-明膠為材料，在明確其對棕色脂肪干細(xì)胞(Brown Adipose Derived Stem Cells, BADSCs)作用基礎(chǔ)上，研究GO-明膠水凝膠攜帶IRONs標(biāo)記的BADSCs在心梗心肌中的分布及分化影響規(guī)律，具體研究結(jié)果如下：
　?。?）IRONs對心肌細(xì)胞微結(jié)構(gòu)及生物

4、活性影響：共沉淀法制備IRONs，表面修飾巰基丁二酸(2,3-Dimercaptosuccinic Acid, DMSA)后制備DMSA-IRONs。通過組織學(xué)染色及western blotting等檢測，表明DMSA-IRONs對心肌細(xì)胞微結(jié)構(gòu)分布影響較小。同時，在心肌細(xì)胞活性影響方面，體外3,3-二氨基聯(lián)苯胺顏色反應(yīng)證明了DMSA-IRONs能夠發(fā)揮類似過氧化酶的活性降低活性氧(Reactive Oxygen Species, RO

5、S)水平，DMSA-IRONs在H2O2處理的心肌細(xì)胞內(nèi)同樣清除了部分ROS，對心肌細(xì)胞起到了保護(hù)作用。
　　（2）DMSA-IRONs對ECTs中閏盤結(jié)構(gòu)的影響：在基于膠原/Matrigel構(gòu)建的三維ECTs中，DMSA-IRONs標(biāo)記后，透射電鏡及普魯士藍(lán)染色顯示細(xì)胞對DMSA-IRONs的吸收與其在ECTs中的分布位置有關(guān)，ECTs邊緣的細(xì)胞大量攝取DMSA-IRONs，而ECTs內(nèi)部細(xì)胞攝取較少，且內(nèi)吞的DMSA-IRON

6、s分布于細(xì)胞質(zhì)及囊泡中。在閏盤結(jié)構(gòu)形成方面，通過免疫熒光及western blotting檢測，證實DMSA-IRONs促進(jìn)ECTs中縫隙結(jié)構(gòu)的形成，降低粘著連接及橋粒的形成。
　?。?）GO-明膠水凝膠對BADSCs向心肌細(xì)胞分化影響研究：制備含不同濃度GO的甲基丙烯酸酯明膠（GO-GelMA）水凝膠，GO對水凝膠多孔狀結(jié)構(gòu)無明顯影響，但增加了水凝膠的電容性。通過結(jié)晶紫染色、MTT檢測等篩選出適合BADSCs粘附及細(xì)胞活性的GO

7、-GelMA水凝膠，同時GO的摻入未明顯影響B(tài)ADSCs的增殖，而免疫熒光染色、western blot檢測顯示，GO-GelMA水凝膠明顯促進(jìn)了BADSCs向心肌細(xì)胞的分化及電傳導(dǎo)相關(guān)蛋白connexin43的極化分布及表達(dá)，并且誘導(dǎo)了ILK-Akt-Erk1/2細(xì)胞信號的表達(dá)。
　?。?）GO-GelMA水凝膠攜帶摻雜鋅的氧化鐵磁納米粒標(biāo)記的BADSCs進(jìn)行的心梗治療研究：利用熱分解鐵前體物質(zhì)的方法制備摻雜鋅的磁納米粒，經(jīng)DM

8、SA表面修飾制備形成具有良好分散能力的磁納米粒，其大小為4.8±0.6 nm。GO-GelMA水凝膠攜帶磁納米粒標(biāo)記的BADSCs進(jìn)行大鼠心梗模型注射，經(jīng)心臟超聲、MRI技術(shù)、組織學(xué)染色等表明，GO-GelMA水凝膠促進(jìn)了BADSCs在心梗區(qū)的存活、遷移及分化，并增加了心臟心室壁的厚度，改善了心臟的收縮功能。
　　綜上，本研究首先明確DMSA-IRONs對心肌細(xì)胞微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞活性的影響，證實DMSA-IRONs發(fā)揮類似過氧化物酶活

9、性降低細(xì)胞內(nèi)ROS，對心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用；利用三維ECTs研究模型，表明DMSA-IRONs的攝取促進(jìn)縫隙連接的形成，降低心肌機(jī)械性能相關(guān)的粘著連接、橋粒斑蛋白表達(dá)。另外，在基于導(dǎo)電支架對BADSCs向心肌細(xì)胞分化規(guī)律與體內(nèi)心梗移植研究中，GO-GelMA水凝膠增強(qiáng)BADSCs的伸展，促進(jìn)向心肌細(xì)胞分化的同時，誘導(dǎo)電傳導(dǎo)相關(guān)蛋白connexin43的表達(dá)及ILK-Akt-Erk1/2信號，同時GO-GelMA水凝膠攜帶BADSCs顯著