COUP-TF I對雄烯銅合成影響的分子機(jī)理研究.pdf

1、雄烯酮是由睪丸生成的一種甾體化合物，是引起公豬膻味的化合物之一。它的沉積水平取決于其在豬體內(nèi)的合成和代謝水平，并由多個基因參與調(diào)控。目前的研究發(fā)現(xiàn)，CYP11A1、CYP17和StAR是雄烯酮合成的主要基因。而COUP-TFⅠ是與雄烯酮合成和代謝基因有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。COUP-TFⅠ已經(jīng)被證實在小鼠、牛和人腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞中是CYP17基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控蛋白，同時，它可抑制StAR的表達(dá)而抑制載體化合物的形成。但卻沒有相關(guān)的研究表明COUP-

2、TFⅠ與豬睪丸中雄烯酮合成分子機(jī)理相關(guān)的CYP11A1、CYP17A1、StAR基因之間存在直接的關(guān)系。本研究擬使用細(xì)胞培養(yǎng)，真核表達(dá)載體構(gòu)建與瞬時轉(zhuǎn)染等方法，利用qRT-PCR、ELISA等分析手段，探究COUP-TFⅠ與豬睪丸中雄烯酮合成途徑中CYP11A1、CYP17A1和StAR之間的關(guān)系，從而闡明COUP-TFⅠ對雄烯酮合成影響的分子機(jī)理，為改善公豬膻味，選育優(yōu)良公豬提供理論依據(jù)。
　　 不同品種及不同月齡階段的豬睪丸

3、及其睪丸間質(zhì)細(xì)胞的生理功能有所不同。有研究表明，低月齡階段公豬的雄烯酮水平低于高月齡階段的雄烯酮水平。本實驗選取幼年期1月齡和成年期6月齡的巴馬香豬睪丸，主要從兩個方面進(jìn)行了研究:
　　 (1)以β-actin作為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR分析不同月齡階段中COUP-TFⅠ、CYP11A1、CYP17A1和StAR基因的相對表達(dá)量，利用ELISA方法測定睪丸組織中雄烯酮的水平;
　　 (2)利用不過篩培養(yǎng)法對1月齡和6

4、月齡的巴馬香豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，構(gòu)建含有篩選基因neo的COUP-TFⅠ真核表達(dá)載體COUP-TFⅠ-neo，并將此重組質(zhì)粒通過瞬時轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)入1月齡和6月齡的豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞，同時以轉(zhuǎn)染pEGFP-C1質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作對照。利用qRT-PCR分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中COUP-TFⅠ、CYP11A1、CYP17A1和StAR的相對表達(dá)量的變化，利用ELISA檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中雄烯酮水平的變化。
　　 通過以上實驗，得到了如下結(jié)

5、果:
　　 (1) COUP-TFⅠ、CYP11A1、CYP17A1和StAR在1月齡和6月齡的睪丸組織中均有表達(dá)。6月齡睪丸組織中COUP-TFⅠ、CYP17A1和StAR的相對表達(dá)量與1月齡相比，差異極顯著(P＜0.01)，而CYP11A1差異顯著(P＜0.05)?？傮w上來看，6月齡睪丸組織中的這四個基因的表達(dá)量高于1月齡睪丸組織相應(yīng)的基因表達(dá)量;1月齡和6月齡睪丸組織中雄烯酮含量分別為1.6583+0.0133 ng/mL

6、和3.3812+0.0214 ng/mL。
　　 (2)構(gòu)建了COUP-TFⅠ-neo重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入了1月齡和6月齡的巴馬香豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞。qRT-PCR結(jié)果顯示:在轉(zhuǎn)入COUP-TFⅠ-neo重組質(zhì)粒后，1月齡和6月齡細(xì)胞中的CYP11A1、CYP17A1和StAR的相對表達(dá)量都出現(xiàn)了降低。并且1月齡和6月齡細(xì)胞中CYP11A1、CYP17A1和StAR的相對表達(dá)量與相應(yīng)的空白對照和轉(zhuǎn)染pEGFP-C1的陰性對照組相比，

7、差異都為極顯著(P＜0.01)。對比未進(jìn)行轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染COUP-TFⅠ-neo重組質(zhì)粒后的1月齡和6月齡細(xì)胞，6月齡細(xì)胞中COUP-TFⅠ、CYP11A1、CYP17A1的相對表達(dá)量與1月齡的相比，差異都極顯著(P＜0.01)，而StAR的相對表達(dá)量差異都顯著(P＜0.05);且未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的6月齡細(xì)胞中CYP11A1、CYP17A1和StAR的相對表達(dá)量高于1月齡細(xì)胞，轉(zhuǎn)染COUP-TFⅠ-neo重組質(zhì)粒后的6月齡細(xì)胞中CYP11A1、C

8、YP17Al和StAR的相對表達(dá)量低于1月齡細(xì)胞。通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染COUP-TFⅠ-neo重組質(zhì)粒的6月齡細(xì)胞的雄烯酮水平與空白對照和轉(zhuǎn)染pEGFP-C1的陰性對照組相比，差異極顯著(P＜0.01);轉(zhuǎn)染COUP-TFⅠ-neo重組質(zhì)粒的1月齡細(xì)胞的雄烯酮水平與空白對照和轉(zhuǎn)染pEGFP-C1的陰性對照組相比，差異顯著(P＜0.05)。
　　 根據(jù)實驗結(jié)果，得出了如下結(jié)論:
　　 (1) COUP-TFⅠ、CY

9、P11A1、CYP17A1和StAR在1月齡和6月齡的睪丸組織中均有表達(dá)，6月齡睪丸組織中這些基因的相對表達(dá)量以及雄烯酮水平都高于1月齡的睪丸組織。睪丸組織中CYP11A1、CYP17A1和StAR的表達(dá)量與雄烯酮水平正相關(guān);
　　 (2)上調(diào)COUP-TFⅠ的表達(dá)可以顯著抑制CYP11A1、CYP17A1和StAR的表達(dá)以及雄烯酮的水平的產(chǎn)生，且COUP-TFⅠ對6月齡細(xì)胞中CYP11A1、CYP17A1和StAR基因以及雄烯