湖泊和土壤中的微生物群落對(duì)氮磷輸入的響應(yīng)研究.pdf

1、微生物在環(huán)境中廣泛分布，它們?cè)谠氐纳锏厍蚧瘜W(xué)循環(huán)、污染物的生物分解、植物的健康生長(zhǎng)、生態(tài)系統(tǒng)的維持和可持續(xù)發(fā)展等方面發(fā)揮重要作用。其中鐵還原細(xì)菌（iron-reducing bacteria，F(xiàn)eRB）因?yàn)槠洫?dú)特的胞外電子傳遞能力而備受關(guān)注，它們可以利用包括Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅳ)、甲基橙、硝基苯等多種物質(zhì)作為電子受體并將其還原，因此在金屬元素循環(huán)和污染物降解等方面有著重大潛能。其重要的模式菌屬為Geobacter和Shewanell

2、a。隨著工農(nóng)業(yè)發(fā)展和城鎮(zhèn)化進(jìn)程，大量的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素被釋放到環(huán)境中，在土壤、水體中富集，導(dǎo)致湖泊等水體環(huán)境的富營(yíng)養(yǎng)化愈加嚴(yán)重和土壤中的營(yíng)養(yǎng)濃度發(fā)生改變，可能會(huì)對(duì)其中的微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生劇烈影響。解析微生物群落對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化和氮肥的響應(yīng)和機(jī)制，對(duì)土壤和水體的富營(yíng)養(yǎng)化治理和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展具有重要意義。因此，本論文以微生物群落結(jié)構(gòu)為研究對(duì)象，深度探索了湖泊沉積物中Geobacter和Shewanella為代表的鐵還原微生物對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化的響應(yīng)和

3、農(nóng)田土壤中微生物群落對(duì)氮肥施加的響應(yīng)和機(jī)制，主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.Shewanella新特異性探測(cè)引物的設(shè)計(jì)及應(yīng)用
　　Shewanella作為模式鐵還原細(xì)菌，在環(huán)境修復(fù)、生物產(chǎn)電等方面具有極大潛力。隨著越來(lái)越多的Shewanella新菌種被發(fā)現(xiàn)，為了更加準(zhǔn)確地調(diào)研Shewanella在環(huán)境中的分布，需要覆蓋率更高的特異性引物來(lái)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。首先，基于目前已知的Shewanella屬菌株的16S rDNA序列的比

4、對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)了Shewanella新引物對(duì)640F/815R和211F/815cR。然后，通過在線模擬引物匹配軟件和實(shí)際環(huán)境樣品的檢測(cè)，與傳統(tǒng)的引物對(duì)783F/1245R、211F/1259R和120F/220R在特異性和覆蓋率方面進(jìn)行了比較。計(jì)算模擬工具測(cè)試的結(jié)果和克隆文庫(kù)數(shù)據(jù)分析的結(jié)果均表明新設(shè)計(jì)的引物對(duì)640F/815R和211F/815cR在覆蓋率和特異性方面均較傳統(tǒng)引物表現(xiàn)更好。將新引物對(duì)應(yīng)用于環(huán)境實(shí)際樣品檢測(cè)，在淡水環(huán)境中檢

5、測(cè)到比之前報(bào)道的更加豐富和多樣的Shewanella，并發(fā)現(xiàn)海洋環(huán)境中的Shewanella種類與淡水環(huán)境中存在顯著差異。Shewanella在污水處理廠中的豐度和多樣性分布受到不同工藝和處理單元的影響，皮爾森相關(guān)性分析顯示污水處理廠中的Shewanella豐度與混合液懸浮固體濃度顯著負(fù)相關(guān)，但是在底泥樣品中Shewanella豐度與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)顯著正相關(guān)，表明Shewanella在不同環(huán)境中的分布可能受不同因素的影響。所設(shè)計(jì)的新特異性引物

6、能夠幫助更準(zhǔn)確地調(diào)研Shewanella的豐度和多樣性分布特點(diǎn)，評(píng)估其在不同環(huán)境中參與生物地球化學(xué)循環(huán)的潛在作用。
　　2.鐵還原細(xì)菌在富營(yíng)養(yǎng)化巢湖湖底沉積物中的分布、豐度和多樣性特征的研究
　　雖然鐵還原細(xì)菌廣泛分布于各種環(huán)境中，但是關(guān)于它們?cè)诟粻I(yíng)養(yǎng)化淡水系統(tǒng)中的豐度和多樣性分布特征尚不清楚。因此，分別采用Geobacter和Shewanella特異性引物和細(xì)菌通用引物，利用定量PCR、克隆文庫(kù)分析和高通量擴(kuò)增子測(cè)序等技術(shù)

7、，探索了鐵還原模式微生物Geobacter和Shewanella，以及總FeRB在富營(yíng)養(yǎng)化巢湖沉積物中的分布特點(diǎn)。研究結(jié)果表明，鐵還原細(xì)菌廣泛分布于富營(yíng)養(yǎng)化巢湖底泥中，且Geobacter、Shewanella和總FeRB的豐度在高污染區(qū)顯著高于低污染區(qū)。其中，在冬季和春季，Geobacter的豐度要高出Shewanella至少一個(gè)數(shù)量級(jí)。Geobacter的生物多樣性顯著高于Shewanella，總共檢測(cè)到61個(gè)與Geobacter相

8、關(guān)的OTUs，但是只有3個(gè)與Shewanella相關(guān)的OTUs。總FeRB主要由Desulfuromonas和Geobacter構(gòu)成。皮爾森相關(guān)性、CCA和RDA的分析結(jié)果表明Geobacter、Shewanella和FeRB的豐度和群落結(jié)構(gòu)與碳、氮和磷含量顯著相關(guān)，而與電子受體-鐵的含量不相關(guān)。因此，在高度富營(yíng)養(yǎng)化淡水湖泊生態(tài)系統(tǒng)中，營(yíng)養(yǎng)水平是調(diào)控鐵還原細(xì)菌分布、豐度和多樣性的主要環(huán)境因子。FeRB的豐度和多樣性與富營(yíng)養(yǎng)化水平的高度關(guān)

9、聯(lián)性表明FeRB在水體富營(yíng)養(yǎng)化治理和污染物修復(fù)方面具有重要潛力。
　　3.無(wú)機(jī)氮肥及其引起的pH變化對(duì)柳枝稷農(nóng)田土壤中細(xì)菌和真菌群落影響的解析
　　雖然關(guān)于無(wú)機(jī)氮肥對(duì)微生物群落影響的研究很多，但是細(xì)菌和真菌群落分別對(duì)氮肥和氮肥引起的pH變化的響應(yīng)及機(jī)制尚不清楚。位于美國(guó)威斯康辛州的ARL和密歇根州的KBS位點(diǎn)的柳枝稷試驗(yàn)田分別有不同長(zhǎng)度的施肥時(shí)間，ARL的短期施肥和KBS的長(zhǎng)期施肥的相互比較可以幫助區(qū)分開氮肥和pH對(duì)微生物群

10、落的影響。分別采用基于16S rRNA基因和ITS2基因的高通量擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，對(duì)細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行了全面分析。結(jié)果顯示ARL位點(diǎn)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成在三個(gè)氮肥濃度（0、56、196kg N/ha）之間無(wú)顯著區(qū)別，但是在KBS位點(diǎn)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成受到高濃度氮肥的顯著影響，而低濃度氮肥對(duì)其無(wú)明顯影響。pH被發(fā)現(xiàn)是引起細(xì)菌群落變化的關(guān)鍵影響因子。與細(xì)菌群落不同，pH對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響較弱，真菌的群落結(jié)構(gòu)和組成更易受到氮肥本身的促進(jìn)或者抑

11、制作用。這些結(jié)果使對(duì)微生物群落對(duì)氮肥的響應(yīng)機(jī)制有了更深刻的認(rèn)識(shí)，為生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的維持和實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了新的思路。
　　4.無(wú)機(jī)氮肥對(duì)微生物群落在柳枝稷生長(zhǎng)周期的影響及無(wú)機(jī)氮肥對(duì)微生物宏基因組和微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)影響的分析
　　以往的相關(guān)研究多關(guān)注于微生物群落結(jié)構(gòu)和組成與氮肥之間的響應(yīng)關(guān)系，而關(guān)于氮肥對(duì)微生物宏基因組和微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的影響卻缺少研究，在植物不同發(fā)育階段氮肥作用下的微生物群落響應(yīng)方面的信息也比較匱乏

12、。通過高通量擴(kuò)增子和鳥槍法宏基因測(cè)序技術(shù)，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等方法，系統(tǒng)探索了這些問題。研究結(jié)果表明，在同一氮肥濃度下，微生物群落結(jié)構(gòu)在整個(gè)柳枝稷的生長(zhǎng)周期總體比較穩(wěn)定，柳枝稷的生長(zhǎng)并沒有引起微生物群落的顯著變化。但是，高濃度氮肥卻使KBS位點(diǎn)的細(xì)菌和真菌群落在柳枝稷不同生長(zhǎng)周期的變化幅度增大。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明在KBS位點(diǎn)，低濃度氮肥使微生物群落抗干擾能力增強(qiáng)，而高濃度氮肥降低了群落抗干擾能力。還發(fā)現(xiàn)在氮肥的影響下，真菌與真菌之間的相互作用

13、減弱，并且微生物群落間的負(fù)相互作用關(guān)系也減弱，從而使總體的相互作用復(fù)雜度降低。宏基因組數(shù)據(jù)注釋結(jié)果顯示KBS位點(diǎn)的高濃度氮肥促進(jìn)很多代謝過程，尤其是碳水化合物的相關(guān)代謝，但是同時(shí)氮肥也會(huì)抑制很多功能基因表達(dá)，特別是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因。氮循環(huán)過程中相關(guān)基因的注釋結(jié)果顯示氮肥抑制了固氮作用，促進(jìn)氨氧化相關(guān)基因表達(dá)，而對(duì)反硝化過程無(wú)顯著影響?？傊蕦?duì)微生物群落的影響是多方面的，群落結(jié)構(gòu)和生理功能代謝的變化可能會(huì)引起微生物之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)的