基于磁性納米顆粒和化學(xué)發(fā)光技術(shù)定量檢測(cè)核酸及其拷貝數(shù)變化的方法研究.pdf

1、拷貝數(shù)變異(Copy Number Variations，CNVs)是一種大小從1 kb到幾個(gè)Mb范圍內(nèi)的DNA片段多態(tài)性，形式包括缺失、插入、重復(fù)以及復(fù)雜的多位點(diǎn)突變等。CNVs廣泛分布于基因組中，是遺傳變異的主要形式之一，對(duì)基因表達(dá)、表型變異以及基因劑量的改變都有很大影響，可以引發(fā)各種復(fù)雜的疾病。對(duì)CNVs的研究可以闡述遺傳疾病的分子機(jī)制，尋找用于基因診斷和產(chǎn)前診斷的分子標(biāo)記，為疾病的分子診斷和新治療方法的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。近年來(lái)，

2、隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，納米材料的應(yīng)用為生物醫(yī)學(xué)的研究和發(fā)展提供了新的技術(shù)和手段。磁性納米顆粒(Magnetic Nanoparticles，MNPs)是納米材料的重要組成部分，由于其具有高表面積、易分離以及良好的生物相容性等特點(diǎn)，目前已被廣泛地應(yīng)用于生物信號(hào)檢測(cè)方面。另外，化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence，CL)技術(shù)因具有較高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度以及儀器要求簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，成為了生物分析研究與發(fā)展的重要工具。本論文研究結(jié)合

3、磁性納米顆粒和化學(xué)發(fā)光技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，建立了一種快速、靈敏和實(shí)用的核酸定量新技術(shù)，并用于CNVs的檢測(cè)，具體研究?jī)?nèi)容包括:
　　1.溶劑熱法制備磁性納米復(fù)合顆粒
　　通過(guò)溶劑熱法制備了粒徑均勻、分散性良好的納米Fe3O4顆粒，在顆粒表面包被上一層SiO2組裝成Fe3O4/SiO2磁性納米復(fù)合顆粒，表征結(jié)果表明該納米復(fù)合顆粒為具有明顯核殼結(jié)構(gòu)的球形實(shí)心顆粒，粒徑約為450nm。在顆粒的SiO2殼層表面進(jìn)行了功能化基團(tuán)修飾，制成了可

4、以結(jié)合氨基化捕獲探針的羧基化MNPs。
　　2.基于磁性納米顆粒、化學(xué)發(fā)光技術(shù)以及引物延伸法的核酸定量檢測(cè)方法研究
　　拷貝數(shù)變異的根本原因?yàn)榛騽┝堪l(fā)生了變化，因此對(duì)CNVs的檢測(cè)和分析即建立在核酸定量分析的基礎(chǔ)上。近年來(lái)，基于磁性納米技術(shù)的核酸分離與檢測(cè)技術(shù)得到了快速發(fā)展，本研究以Fe3O4/SiO2磁性復(fù)合顆粒為固相載體，以人工合成的單鏈模擬片段(GAPDH，，GSTT1，GSTM1)為檢測(cè)目標(biāo)，通過(guò)引物一次延伸法和化

5、學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，擬建立一種新的核酸定量方法。通過(guò)在MNPs表面修飾的捕獲探針，對(duì)引物一次延伸得到的含有biotin-dUTP的特異性片段進(jìn)行雜交捕獲，然后與鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)結(jié)合，最后加入3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-羥基)苯-1，2-二氧雜環(huán)丁烷磷酸(3-(2'-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3"-phosphoryloxy)

6、 phenyl-1,2-dioxetane,AMPPD)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系實(shí)現(xiàn)快速特異性檢測(cè)，初步結(jié)果表明該方法在核酸檢測(cè)方面具有良好的特異性和靈敏度。隨后對(duì)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，得出了最佳的顆粒羧基化修飾濃度、氨基化探針修飾濃度、顆粒用量以及雜交溫度。在最優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行了模擬核酸的定量分析，結(jié)果顯示在模板濃度為0.625-10μM的范圍內(nèi)，CL信號(hào)與三個(gè)基因的模板濃度均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，表明該方法可以在

7、一定范圍內(nèi)進(jìn)行核酸的定量分析，但由于較高的檢測(cè)限并不適用基因組DNA樣本的檢測(cè)，需要進(jìn)一步地提高靈敏度，拓寬檢測(cè)信號(hào)的線性范圍。
　　3.基于磁性納米顆粒、化學(xué)發(fā)光以及探針連接依賴擴(kuò)增技術(shù)的核酸定量檢測(cè)方法的研究
　　為了實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大以及能夠在基因組DNA中進(jìn)行核酸定量檢測(cè)，我們以Fe3O4/SiO2磁性復(fù)合顆粒為固相雜交載體，以化學(xué)發(fā)光技術(shù)為檢測(cè)手段，結(jié)合探針連接依賴的擴(kuò)增技術(shù)發(fā)展了一種新的核酸定量檢測(cè)方法。通過(guò)一對(duì)

8、末端帶有通用引物的相鄰探針同時(shí)與模板片段雜交，并在DNA連接酶的作用下連接成可擴(kuò)增的特異性片段，利用通用引物擴(kuò)增得到的目標(biāo)產(chǎn)物可被MNPs表面修飾的探針捕獲，最后通過(guò)ALP-AMPPD反應(yīng)體系進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。針對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的需要，對(duì)MNPs-CL體系進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化:MNPs的最佳羧基化修飾濃度為1 mM;最佳修飾探針為含有手臂分子的3'端結(jié)合于MNPs的3'NH2-(T)15探針，最佳探針修飾濃度為10μM;最佳MNPs

9、用量為300μg; DNA捕獲探針的最佳雜交溫度為52℃;探針連接依賴的PCR擴(kuò)增最佳循環(huán)數(shù)為25;雜交體系中最佳雜交產(chǎn)物量為4μL。在最優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行了模擬核酸定量檢測(cè)和分析，得到了檢測(cè)限10fM，在初始模板濃度為0.02-200 pM的范圍內(nèi)，CL信號(hào)值與模板濃度的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2=0.987)。研究結(jié)果表明該方法具有較高的特異性和靈敏度，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)基因組DNA的定量檢測(cè)和基因拷貝數(shù)變化的分析提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

10、r>　　4.基于磁性納米顆粒、化學(xué)發(fā)光以及探針連接依賴的擴(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)CNVs的方法研究
　　雖然前人在研究MNPs-CL核酸傳感器的過(guò)程中，同樣結(jié)合了磁分離技術(shù)和酶促化學(xué)發(fā)光信號(hào)放大技術(shù)，但他們檢測(cè)的靶序列大都是人工合成的模擬單鏈小片段核酸分子，而在基因組DNA中對(duì)長(zhǎng)鏈、雙鏈DNA的檢測(cè)卻鮮有報(bào)道。為了進(jìn)行方法學(xué)評(píng)估，驗(yàn)證其實(shí)用性，我們利用已建立的基于MNPs-CL系統(tǒng)和探針連接依賴的擴(kuò)增技術(shù)的核酸定量檢測(cè)方法對(duì)基因組DNA中的

11、CNVs位點(diǎn)進(jìn)行了定量檢測(cè)和分析。通過(guò)對(duì)整合到質(zhì)粒DNA中的模擬基因序列的拷貝數(shù)變化分析，結(jié)果初步顯示該方法在檢測(cè)基因組中目標(biāo)基因拷貝數(shù)變化方面具有較好的特異性。然后對(duì)40個(gè)人類基因組DNA樣本（包括了男性、女性以及染色體21三體綜合征樣本）中的6個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行了定量檢測(cè)，通過(guò)與內(nèi)參基因的比較分析得出拷貝數(shù)的變化，結(jié)果顯示僅有1個(gè)基因的拷貝數(shù)存在不確定性。而作為對(duì)照方法的多重連接探針依賴的擴(kuò)增技術(shù)(Multiplex Ligation-

12、dependent ProbeAmplification，MLPA)的檢測(cè)結(jié)果，有2個(gè)基因的拷貝數(shù)偏離了期望值，表明MNPs-CL系統(tǒng)檢測(cè)的準(zhǔn)確度可與目前的MLPA技術(shù)相媲美，可以適用于CNVs位點(diǎn)分析，為研究CNVs與疾病的相關(guān)性提供了新的技術(shù)和手段。
　　5.基于金磁納米復(fù)合顆粒和熒光技術(shù)的核酸定量檢測(cè)方法的研究
　　在摸索新的核酸定量檢測(cè)方法的過(guò)程中，我們還利用金磁納米復(fù)合顆粒(Gold-coated Magnetic

13、 Nanocomposites，GMNPs)和熒光進(jìn)行定量檢測(cè)方法的研究。利用實(shí)驗(yàn)室自制的低熒光背景的Fe3O4@SiO2@Au(GMNPs)作為固相雜交載體，以人工合成的單鏈模擬片段為檢測(cè)目標(biāo)，以熒光掃描技術(shù)為檢測(cè)手段，分別結(jié)合引物在位延伸法和探針連接依賴的擴(kuò)增技術(shù)探索新的核酸定量檢測(cè)方法。對(duì)兩個(gè)檢測(cè)體系的相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，包括引物在位延伸體系的顆粒用量、熒光雜交探針濃度和雜交溫度以及探針連接擴(kuò)增體系的Ligase buffer