骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2誘導(dǎo)成骨過(guò)程中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)及意義.pdf

1、第一部分骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2誘導(dǎo)成骨過(guò)程中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)及分析 目的探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2)誘導(dǎo)成骨過(guò)程中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的表達(dá)情況，以加深對(duì)BMP-2誘導(dǎo)成骨機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為BMP-2的進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。 方法采用昆明鼠20只，外科手術(shù)建立股部肌袋誘導(dǎo)成骨模型，以左

2、側(cè)大腿為實(shí)驗(yàn)組，右側(cè)為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組肌袋內(nèi)植入以明膠和羥基磷灰石復(fù)合物為載體的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)0.25mg；對(duì)照組僅植入空白載體。分別于術(shù)后3、7、14和21天取材，采用原位雜交和免疫組化方法檢測(cè)VEGFmRNA及蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果術(shù)后3d可見大量間充質(zhì)細(xì)胞聚集，胞漿出現(xiàn)VEGF的表達(dá)，但隨著間充質(zhì)細(xì)胞分化為前軟骨細(xì)胞并不斷成熟，VEGF在間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)逐漸消失，而在成軟骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

3、水平迅速提高，VEGF在成熟軟骨細(xì)胞中的表達(dá)最為活躍，至到新骨形成，在成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中仍可檢測(cè)到VEGF的強(qiáng)烈表達(dá);而對(duì)照組則未檢測(cè)到VEGF的表達(dá)。 結(jié)論VEGF的表達(dá)貫穿BMP-2誘導(dǎo)成骨的全過(guò)程，并在成熟軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)烈表達(dá)；BMP-2具有促進(jìn)VEGF合成與分泌的作用。盡管VEGF在這一過(guò)程中的意義尚不完全明確，但這對(duì)進(jìn)一步闡明BMP-2誘導(dǎo)成骨的機(jī)制提供了新的思路，為BMP-2的進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

4、 第二部分鼠胚成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定 目的探討一種經(jīng)濟(jì)、高效的原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 方法孕齡19d的KM小鼠，無(wú)菌條件下剖腹取出胎鼠，然后取胎鼠的顱蓋骨，剔凈、漂洗、剪碎。用0.25％胰蛋白酶消化10min，終止消化后將碎骨塊接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，通過(guò)相差顯微鏡、透射電鏡觀察，堿性磷酸酶染色、骨鈣素免疫組化染色和鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色等方法對(duì)所獲得細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 結(jié)果所培養(yǎng)的細(xì)胞具

5、有典型的成骨細(xì)胞形態(tài)特征，堿性磷酸酶染色、骨鈣素染色和鈣結(jié)節(jié)染色均呈陽(yáng)性。 結(jié)論改良的組織塊培養(yǎng)法可在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量成骨細(xì)胞，所培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型的成骨細(xì)胞形態(tài)和功能。 第三部分BMP-2促進(jìn)鼠胚成骨細(xì)胞VEGF表達(dá)的劑量依賴性效應(yīng) 目的通過(guò)不同劑量重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2，rhBMP-2)刺激原代培養(yǎng)的小鼠胚胎成骨細(xì)胞，探

6、討B(tài)MP-2對(duì)成骨細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表達(dá)的影響。 方法取19d胎齡的小鼠胚胎顱骨成骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，采用RT-PCR和Westernblot法分別檢測(cè)不同濃度rhBMP-2對(duì)成骨細(xì)胞VEGFmRNA及蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果RT-PCR及Westernblot法檢測(cè)表明，VEGFmRNA及蛋白在原代成骨細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)；半定量分析證實(shí)，不同rhB

7、MP-2劑量組間VEGFmRNA的表達(dá)量呈一定變化規(guī)律，隨著rhBMP-2濃度的升高，VEGFmRNA的表達(dá)量逐漸增加，當(dāng)rhBMP-2劑量為300ng/ml左右時(shí)，VEGFmRNA的表達(dá)量最高，超過(guò)此劑量，VEGF的表達(dá)則有下降趨勢(shì)。 結(jié)論VEGF可在原代鼠胚成骨細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)；rhBMP-2可促進(jìn)VEGF在成骨細(xì)胞的表達(dá)，并呈一定的劑量依賴性關(guān)系，rhBMP-2劑量為300ng/ml左右時(shí)，其促進(jìn)作用最佳。 第四部分

8、BMP-2促進(jìn)鼠胚成骨細(xì)胞VEGF表達(dá)的時(shí)間依賴性效應(yīng) 目的探討B(tài)MP-2促進(jìn)鼠胚成骨細(xì)胞VEGF表達(dá)的時(shí)間規(guī)律。 方法取19d胎齡的小鼠胚胎顱骨成骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，采用RT-PCR法分別檢測(cè)不同作用時(shí)間下rhBMP-2(300ng/ml)對(duì)成骨細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果RT-PCR法檢測(cè)表明，應(yīng)用相同劑量rhBMP-2(300ng/ml)刺激成骨細(xì)胞時(shí)，不同作用時(shí)間下VEGFmRNA的表達(dá)量不同，

9、呈雙時(shí)相，分別在3h和24h時(shí)出現(xiàn)峰值，48h時(shí)VEGFmRNA的表達(dá)仍保持較高水平。減除各自對(duì)照組的影響，各時(shí)間點(diǎn)VEGF表達(dá)的相對(duì)值([rhBMP-2組/對(duì)照組]比值)亦呈時(shí)間依賴性關(guān)系，6h時(shí)明顯升高，約為對(duì)照組的2.6倍(P＜0.05)。VEGFmRNA的第2個(gè)峰值出現(xiàn)在大約36h左右，約為對(duì)照組的2倍。48h時(shí)，VEGFmRNA的相對(duì)水平仍然保持較高水平。 結(jié)論rhBMP-2對(duì)VEGF表達(dá)的促進(jìn)作用呈時(shí)間依賴關(guān)系，分別

10、在3h和24h時(shí)出現(xiàn)峰值，48h時(shí)VEGFmRNA的表達(dá)仍保持較高水平。減除各自對(duì)照組的影響，各時(shí)間點(diǎn)VEGF表達(dá)的相對(duì)值(rhBMP-2組/對(duì)照組)亦呈時(shí)間依賴性效應(yīng)，兩個(gè)峰值分別出現(xiàn)在6h或36h左右。 第五部分BMP-2促進(jìn)鼠胚成骨細(xì)胞VEGF表達(dá)的機(jī)制研究 目的探討重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2，rhBMP-2)促進(jìn)鼠胚成骨細(xì)胞血管內(nèi)

11、皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表達(dá)的機(jī)制。 方法取19d胎齡的小鼠胚胎顱骨成骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，在加入rhBMP-2誘導(dǎo)成骨的同時(shí)，分別加入放線菌素D、放線菌酮和羥(基)脲等三種藥物，RT-PCR法檢測(cè)VEGFmRNA表達(dá)的變化。 結(jié)果應(yīng)用放線菌素D阻斷基因轉(zhuǎn)錄后，可降低對(duì)照組成骨細(xì)胞VEGFmRNA的表達(dá)，并可完全抑制BMP-2對(duì)VEGF表達(dá)的促進(jìn)作用。用放線菌酮

12、阻斷成骨細(xì)胞的蛋白合成后，可增加對(duì)照組成骨細(xì)胞VEGFmRNA的表達(dá)，但并不能完全抑制BMP-2對(duì)VEGFmRNA表達(dá)的促進(jìn)作用。應(yīng)用羥(基)脲阻斷DNA合成后，可抑制BMP-2對(duì)VEGF分泌的促進(jìn)作用。 結(jié)論rhBMP-2對(duì)鼠胚成骨細(xì)胞VEGF基因表達(dá)的促進(jìn)作用，主要通過(guò)促進(jìn)VEGFmRNA的轉(zhuǎn)錄，并與BMP-2的促有絲分裂活性密切相關(guān)，新蛋白的合成并不是促進(jìn)VEGFmRNA表達(dá)的必要條件。 第六部分血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在

13、BMP-2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞過(guò)程中的作用 目的探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2)誘導(dǎo)成骨過(guò)程中的作用。 方法(1)取小鼠胚胎成骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，RT-PCR法檢測(cè)rhBMP-2(300ng/ml)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化過(guò)程中VEGF受體(VEGFreceptors，VEGF-R)的表

14、達(dá)。(2)采用VEGF反義寡核苷酸和蘇拉明分別阻斷VEGF的合成及功能，觀察對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶(alkalinephosphataseactivities，AP)活性和鈣結(jié)節(jié)形成的影響。(3)在rhBMP-2誘導(dǎo)成骨的同時(shí)，添加不同濃度的外源性VEGF，觀察對(duì)成骨細(xì)胞體外礦化能力的影響。 結(jié)果(1)RT-PCR法可檢測(cè)到VEGF-R(Flk-1和Flt-1)mRNA在成骨細(xì)胞呈穩(wěn)定弱表達(dá)，rhBMP-2干預(yù)24h后VEGF-R

15、的表達(dá)量無(wú)明顯變化。(2)應(yīng)用VEGF反義寡核苷酸(VEGFantisenseoligodeoxynucleotides，VEGFASODNs)和蘇拉明阻斷VEGF的合成和功能后，可抑制rhBMP-2所誘導(dǎo)的AP活性和鈣結(jié)節(jié)形成，并存在劑量依賴效應(yīng)。(3)用不同濃度的VEGF干預(yù)成骨細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)VEGF并不能使成骨細(xì)胞分化為鈣結(jié)節(jié)，外源性VEGF的加入亦不影響rhBMP-2刺激鈣結(jié)節(jié)形成的能力。 結(jié)論VEGF在成骨細(xì)胞可以自分