T-2毒素對(duì)雞脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的毒害及其機(jī)理研究.pdf

1、T-2毒素是毒性最強(qiáng)的A型單端孢霉烯族化合物，也是一種常見(jiàn)的引起動(dòng)物骨發(fā)育不良的真菌毒素。T-2毒素引起的肉雞骨發(fā)育異常主要表現(xiàn)為脛骨生長(zhǎng)板軟骨發(fā)育不良。發(fā)病雞脛骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞不能進(jìn)行正常的軟骨內(nèi)骨化，在骨骺端形成軟骨栓楔入骨骺甚至深入到骨髓腔，引起病雞關(guān)節(jié)畸形，脛骨干髓區(qū)脆弱，最終導(dǎo)致骨折發(fā)病率大大增加。研究表明，此種疾病的主要原因是骨骺生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞發(fā)育停滯、凋亡或壞死進(jìn)而造成正常的軟骨內(nèi)骨化過(guò)程紊亂。然而，過(guò)去關(guān)于T-2毒素對(duì)骨

2、系統(tǒng)毒害作用的體內(nèi)與體外研究主要集中在發(fā)病動(dòng)物脛骨的病理變化和T-2毒素對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外代謝的影響等方面的研究，對(duì)T-2毒素作用于長(zhǎng)骨發(fā)生器官生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的毒性研究相對(duì)較少。因此，為揭開(kāi)T-2毒素對(duì)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞毒害作用和為生產(chǎn)實(shí)踐提供科學(xué)的防治方法，同時(shí)為T-2毒素引起的人或動(dòng)物疾病機(jī)理的研究提供借鑒，本試驗(yàn)利用本實(shí)驗(yàn)室建立的雞生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，展開(kāi)T-2毒素對(duì)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的毒害及機(jī)制的研究。
　　 試驗(yàn)I雞

3、生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與生物學(xué)特性的研究
　　 體外培養(yǎng)的原代生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞是研究骨生長(zhǎng)板發(fā)育及調(diào)節(jié)的一個(gè)重要工具，對(duì)軟骨組織工程的研究也有重要的意義。同時(shí)，各種原因?qū)е碌纳L(zhǎng)板軟骨發(fā)育不良的疾病機(jī)制的深入研究，也促使建立一種簡(jiǎn)易、高效的生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞體外的培養(yǎng)方法。本試驗(yàn)收集6w齡肉雞的脛骨生長(zhǎng)板，削成薄片后置于含有0.1％膠原酶和0.1%透明質(zhì)酸酶的消化液中，37℃消化14～16 h。經(jīng)梯度離心獲得的軟骨細(xì)胞懸浮于高糖D

4、MEM(含10% FBS)培養(yǎng)基，然后按105個(gè)/cm2接種于培養(yǎng)板，觀察和分析軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特征。應(yīng)用MTT法測(cè)定軟骨細(xì)胞增殖速度并繪制生長(zhǎng)曲線，倒置顯微鏡和電鏡下觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、甲苯胺藍(lán)染色鑒定細(xì)胞分泌的基質(zhì)和用II型膠原和骨鈣素的免疫組織化學(xué)法進(jìn)一步鑒定軟骨細(xì)胞分泌的特異性蛋白．同時(shí)，試驗(yàn)過(guò)程中測(cè)定了軟骨細(xì)胞膠原蛋白和酸性蛋白聚糖的含量變化、堿性磷酸酶的活性和軟骨細(xì)胞肥大化時(shí)的特異性基因X型膠原mRNA的表達(dá)。最后用茜素

5、紅結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定軟骨細(xì)胞在體外的鈣化能力。結(jié)果表明，采用本試驗(yàn)方法所分離的生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞成活率達(dá)98%以上；原代培養(yǎng)細(xì)胞呈圓形或多角形且II型膠原陽(yáng)性染色細(xì)胞比例大于98%。堿性磷酸酯酶、膠原及細(xì)胞外基質(zhì)合成和X型膠原mRNA表達(dá)隨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)了一個(gè)周期性的變化。軟骨細(xì)胞培養(yǎng)初期添加25μg·mL-1的維生素C有助于防止軟骨細(xì)胞退化。結(jié)論：本試驗(yàn)建立的生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)方法可獲得高純度、高活性的軟骨細(xì)胞。分離培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞

6、可在體外培養(yǎng)過(guò)程中保持表型，逐漸成熟和最終礦化軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，為探討其生物學(xué)特性、軟骨細(xì)胞增殖分化的調(diào)控和軟骨組織工程的研究建立了基礎(chǔ)．
　　 試驗(yàn)Ⅱ無(wú)機(jī)磷誘導(dǎo)的生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞體外鈣化體系的建立
　　 磷是參與動(dòng)物骨代謝的重要元素之一，它在生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞終末分化過(guò)程中起著重要的作用。本試驗(yàn)通過(guò)在體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加不同濃度的無(wú)機(jī)磷(0～7 mmol·L-1)，研究磷在體外環(huán)境下對(duì)細(xì)胞終末分化及鈣化的影響

7、。試驗(yàn)結(jié)果表明，(1)無(wú)機(jī)磷可降低軟骨細(xì)胞增長(zhǎng)速度，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分化；(2)磷對(duì)成熟型的生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的促進(jìn)鈣化作用明顯，對(duì)不成熟軟骨細(xì)胞的鈣化促進(jìn)作用較??；(3)磷誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞鈣化的能力與軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的時(shí)間和細(xì)胞的匯合程度密切相關(guān)，即培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，匯合程度越高，磷誘導(dǎo)其鈣化的速度越快，且誘導(dǎo)鈣化需要的磷的濃度也越低；在此過(guò)程中，細(xì)胞開(kāi)始鈣化時(shí)，細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酯酶的活性最高。(4)高濃度(7 mmol·L-1)的無(wú)機(jī)磷引起細(xì)胞的迅

8、速死亡。茜素紅染色表明，高濃度與低濃度無(wú)機(jī)磷形成的鈣化結(jié)節(jié)的機(jī)制可能不一樣，添加3 mmol·L-1的無(wú)機(jī)磷更有助于軟骨細(xì)胞的生理性鈣化作用。通過(guò)此種方法建立的生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞體外鈣化體系為下一步關(guān)于軟骨細(xì)胞鈣化機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為研究那些影響軟骨細(xì)胞鈣化過(guò)程的因素提供一個(gè)可體外操作的研究的體系。
　　 試驗(yàn)Ⅲ T-2毒素對(duì)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖、分化和鈣化的影響
　　 T-2毒素是常見(jiàn)的影響動(dòng)物骨發(fā)育的毒素之一，它

9、可引起快速生長(zhǎng)的肉雞脛骨生長(zhǎng)板的肥大軟骨細(xì)胞不能正常的鈣化，導(dǎo)致骨骺軟骨發(fā)育畸形．本試驗(yàn)利用本試驗(yàn)室建立的軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系研究T-2毒素對(duì)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞增殖、分化和鈣化的影響，為進(jìn)一步研究T-2毒素引起動(dòng)物骨發(fā)育不良的機(jī)理打下基礎(chǔ)。雞生長(zhǎng)軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)到匯合后培養(yǎng)在含3 mmol·L-1無(wú)機(jī)磷的礦化培養(yǎng)基中，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的T-2毒素，觀察與測(cè)定與軟骨細(xì)胞增殖、分化和鈣化相應(yīng)指標(biāo)。結(jié)果顯示，T-2毒素能顯著降低

10、軟骨細(xì)胞的活力（P<0.05）。同時(shí)，軟骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性、蛋白聚糖的合成、培養(yǎng)細(xì)胞礦化及細(xì)胞基質(zhì)層鈣，磷沉積量均顯著降低（P<0.01）．實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究表明，暴露于T-2毒素的的軟骨細(xì)胞中的X型膠原、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子RUNX2的mRNA水平也相應(yīng)的降低（P<0.05）。結(jié)論：T-2毒素可通過(guò)改變細(xì)胞的代謝活性和調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)抑制軟骨細(xì)胞的增殖分化以及隨后的礦化。
　　 試驗(yàn)

11、Ⅳ T-2毒素對(duì)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞凋亡及Caspase-3基因表達(dá)的影響
　　 T-2毒素可對(duì)人和動(dòng)物的多種器官產(chǎn)生毒害作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是T-2毒素發(fā)揮毒害作用的重要途徑之一。本試驗(yàn)通過(guò)在體外分離培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中添加不同濃度的T-2毒素，研究T-2毒素對(duì)培養(yǎng)軟骨細(xì)胞凋亡的影響。采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定T-2毒素處理的軟骨細(xì)胞凋亡、活性氧、線粒體跨膜電位和自由[Ca2+]i的變化，Hoechst33342染色后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核結(jié)構(gòu)

12、的變化。同時(shí)應(yīng)用Real-time RT PCR的方法測(cè)定細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3 mRNA表達(dá)量。應(yīng)用生物化學(xué)測(cè)定法測(cè)定軟骨細(xì)胞內(nèi)GPx活性。結(jié)果顯示，T-2毒素可引起軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS、自由[Ca2+]i升高、線粒體跨膜電位降低(P<0.05)。Hoechst33342染色后，熒光顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核發(fā)生凝集，呈現(xiàn)凋亡時(shí)核形態(tài)變化。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶GPx有一定程度的升高。試驗(yàn)結(jié)果表明，T-2毒素可通過(guò)引起軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)

13、失衡導(dǎo)致生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡性死亡。
　　 試驗(yàn)V T-2毒素引起的生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激及NAC的保護(hù)作用
　　 T-2毒素是一種可引起動(dòng)物多種骨發(fā)育畸形的常見(jiàn)真菌毒素。T-2毒素引起的氧化應(yīng)激是T-2毒素引起動(dòng)物發(fā)病的重要病理機(jī)制之一．在本試驗(yàn)中，原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞給予不同濃度T-2毒素（5，50，500 nmol·L-1）處理后，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑N。乙酰半胱氨酸(NAC)研究它對(duì)T-2毒素引起的氧化應(yīng)激