低能激光照射對大鼠梗死心肌組織中氧自由基和心室重塑的影響.pdf

1、1.研究背景和目的:
　　 心肌梗死(myocardialinfarction，MI)后一系列組織學和病理學變化最終可導(dǎo)致心室重塑(ventricularremodeling，VR)，其可引發(fā)左心室功能不全的發(fā)生。VR是一個涉及心肌細胞丟失、膠原纖維大量形成的復(fù)雜過程，并以心肌細胞肥大，纖維化，細胞外基質(zhì)沉積和心臟基因表達的改變?yōu)樘卣?，是心臟對于負荷過重的一種生理性適應(yīng)性反應(yīng)。部分重癥病人，這種最初的適應(yīng)性反應(yīng)會變得適應(yīng)不良，最

2、終導(dǎo)致心臟衰竭的發(fā)生率和死亡率升高。藥物治療和以溶栓、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)（percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty,PTCA）和冠狀動脈旁路移植術(shù)（coronaryarterybypassgrafting，CABG）為代表的再血管化治療可以顯著減少心肌梗死面積，改善局部血液循環(huán)，挽救瀕死的心肌，在很大程度上延緩了心臟衰竭的發(fā)生。心力衰竭的發(fā)生不僅涉及心肌壞死，還與心肌細胞凋亡有關(guān)。心肌梗

3、死發(fā)生后，心肌缺血中心區(qū)以心肌細胞死亡為主，而在缺血區(qū)的邊緣部分則有大量的心肌細胞發(fā)生凋亡。大量研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死后惡劣的心肌微環(huán)境與心肌細胞壞死和和凋亡密切相關(guān)。
　　 眾所周知，氧自由基（oxygenfreeradicals，OFR）在心肌損傷，尤其是缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要的作用。心肌缺血、缺氧及心肌缺血再灌注時氧自由基爆發(fā)性形成增多，與細胞膜磷脂中的較多的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞細胞膜的完整結(jié)構(gòu)，流動性降低，通

4、透性增高，并使存在于細胞膜上的膜蛋白（酶、受體、離子通道）活性降低，同時，膜磷脂的過氧化可經(jīng)過磷脂酶C、D，進一步分解膜磷脂，增加OFR生成和脂質(zhì)過氧化，OFR可以與蛋白質(zhì)多肽鏈上的氨基酸殘基、巰基等發(fā)生氧化反應(yīng)，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)發(fā)生變性、降解。超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）活性的高低可以反映出組織清除氧自由基的能力，而丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量可以反映脂質(zhì)過氧化的水

5、平。
　　 低能激光照射(lowlevellaserirradiation，LLLI)在醫(yī)學領(lǐng)域的研究和應(yīng)用已有60余年的時間。動物實驗和臨床實踐充分證明，LLLI是安全、有效的，并且可以調(diào)節(jié)多種生物學過程，比如:加快側(cè)支循環(huán)血液運行，改善微循環(huán);促進傷口愈合;減輕炎癥反應(yīng)和促進成骨細胞、淋巴細胞、關(guān)節(jié)軟骨細胞、成纖維細胞等細胞的復(fù)制。多年來，Oron和他的團隊發(fā)現(xiàn)LLLI可以顯著減少大鼠和狗心肌梗死后瘢痕組織的形成和心肌梗死面

6、積，并且還發(fā)現(xiàn)LLLI可以上調(diào)大鼠梗死心肌組織中血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase，iNOS）的表達，促進血管生成，具有一定的心肌保護作用。另外，LLLI可以刺激骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrowderivedmesenchymalstemcells，BMSCs)的復(fù)制、生長因子的分泌和向心肌方向的

7、分化。
　　 然而，據(jù)我們所知，目前對于大鼠MI后3周應(yīng)用LLLI對梗死心肌組織中OFR和VR過程的影響的研究較少。因此，本研究旨在探討MI后3周應(yīng)用波長為635nm的二極管低能激光對大鼠梗死心肌組織中OFR和VR的影響。
　　 2.材料和方法:
　　 2.1120只雌性清潔級SD大鼠隨機分為3組:假手術(shù)組（sham組，30只），對照組（control組，45只），LLLI治療組（LLLI組，45只）。通過結(jié)扎左

8、冠狀動脈前降支建立大鼠心肌梗死模型，術(shù)前30分鐘肌肉注射青霉素20萬單位預(yù)防感染，10％水合氯醛溶液(300g/kg)腹腔注射麻醉，備皮，氣管插管并呼吸機輔助呼吸(頻率70次/分，潮氣量3ml/100g)，胸骨左緣第4肋與第5肋間打開胸腔，充分暴露心臟，以左冠狀靜脈為標志，用6-Oprolene線在肺動脈圓錐和左心耳間距主動脈根部約3～4mm處，連同一束心肌結(jié)扎左冠狀動脈前降支，穿針后于心臟表面噴灑0.05m12％利多卡因注射液，待心律

9、規(guī)整后結(jié)扎縫線，以心臟前壁局部顏色變?yōu)榘咨珵闃酥荆饘雨P(guān)胸。假手術(shù)組手術(shù)操作同模型操作，但冠狀動脈只穿線不結(jié)扎縫線。手術(shù)結(jié)束后30℃下保溫至大鼠蘇醒，術(shù)后三天每天肌肉注射青霉素20萬單位預(yù)防感染，飲食充足供應(yīng)。
　　 2.2MI后3周，所有大鼠再次開胸暴露心臟，可見心肌梗死區(qū)呈白色，與周圍正常心肌組織區(qū)別明顯，LLLI組大鼠給予二極管激光照射（波長635nm，功率6mW，照射時間125s，能量密度0.96J/cm2），然后關(guān)胸逐

10、層縫合。Sham組和control組操作同前，但是不開通激光電源。
　　 2.3分別于MI后3周再次開胸后二次開胸后1h，24h，48h，72h，1周時，每組取4-6只大鼠處死大鼠，取出心臟，保證MI后4周每組剩余5只大鼠。采集各組大鼠整塊梗死的心肌組織部分，迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。標本采集結(jié)束后，取保存的新鮮心肌組織在低溫條件下制備組織勻漿液，分別以黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，具體操作按照

11、試劑盒說明書進行。
　　 2.4大鼠MI后4周，每組5只大鼠10％水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，開胸取出大鼠心臟，剪去多余的結(jié)締組織和大血管，應(yīng)用生理鹽水充分沖洗至心腔內(nèi)無血液殘留，部分大鼠心臟行TTC染色，部分放入10％甲醛溶液中固定，冠狀動脈結(jié)扎處以下部分平行于房室溝做一切面，取結(jié)扎線以下部分制備常規(guī)石蠟切片(5μm)，用于TTC染色、HE染色和Masson染色，觀察并測量MI后心肌組織、心肌梗死面積、左室室壁厚度和膠原纖維含量

12、等變化。
　　 2.5統(tǒng)計每組數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)以(x)±s表示，并用統(tǒng)計軟件SPSS17.0處理，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，檢驗水準p=0.05。
　　 3.結(jié)果:
　　 3.1制備大鼠心梗模型的成功率約為77.8％，LAD結(jié)扎后可見左心室局部顏色變白。3周后切取心臟肉眼觀可以觀察到明顯的梗死區(qū)，與周邊正常心肌區(qū)別明顯。組織切片TTC染色、HE染色和Masson染色均顯示梗死區(qū)的心肌組織壞

13、死，正常的心肌結(jié)構(gòu)消失，有較多膠原纖維組織形成，與梗死區(qū)周圍正常的心肌組織有明顯區(qū)別，MI造模成功。
　　 3.2Control組和LLLI組大鼠梗死心肌組織中SOD活性比sham組明顯降低(p＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義，各組心肌組織中SOD活性呈現(xiàn)出術(shù)后1h到48h逐漸升高，48h時達到最高，隨后至1周逐漸降低的趨勢。LLLI組大鼠SOD活性在各時間點均較control組降低(p＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。

14、　　 3.3Control組和LLLI組大鼠梗死心肌組織中MDA含量較sham組顯著升高(p＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義，各組MDA含量呈現(xiàn)出從1h至48h逐漸降低，48h時最低，隨逐漸升高的趨勢，1周時各組差異仍具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。各時間點LLLI組MDA含量均較control組增高(p＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 3.4LLLI組大鼠心肌梗死面積較control組明顯減少(18±9％vs35±1

15、0％，p＜0.05)差異具有統(tǒng)計學意義;MI后，左心室室壁厚度較sham組(1.32±0.04mm)明顯減少，LLLI后左心室室壁厚度較control組明顯增加（0.84±0.02mmvs0.31±0.03mm，p＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 3.5sham組大鼠左心室壁膠原纖維含量為4.81±0.40％，LLLI組(30.97±2.60％)和control組(64.34±2.20％)較sham組明顯增加(p＜0.0