條件性敲除系統(tǒng)研究瘧原蟲必需基因功能.pdf

1、瘧疾是由原蟲類寄生蟲瘧原蟲感染引起的熱帶疾病，是目前危害人類健康的主要傳染性疾病之一。感染地區(qū)主要分布在撒哈拉沙漠以南的非洲地區(qū)以及東南亞。5歲以下的兒童是瘧疾易感人群。感染瘧疾的病人表現(xiàn)出嚴重貧血、代謝性酸中毒、肺衰竭以及腦瘧等病理特征。抗瘧疾類藥物是目前最有效的控制和治療瘧疾的手段。然而由于耐藥瘧原蟲株的出現(xiàn)，尤其在東南亞地區(qū)出現(xiàn)耐青蒿素的瘧原蟲株，使得瘧疾防治工作面臨越來越大的困難，因此，人們寄希望于高保護效率的瘧疾疫苗。研究瘧原

2、蟲基因的功能以及瘧原蟲與宿主之間的相互作用將為研發(fā)瘧疾疫苗和發(fā)現(xiàn)新的抗瘧藥物靶標提供可靠的信息。瘧原蟲生長發(fā)育的紅細胞期（紅內期）階段，是引起瘧疾病人嚴重臨床病理的階段，此階段，瘧原蟲是單倍體基因組，因此使用永久性基因敲除技術無法研究必需基因的功能。在我們的研究中，我們使用小鼠伯氏瘧原蟲(Plasmodiumberghei)和夏氏瘧原蟲(Plasmodiumchabaudi)作為瘧疾研究的模型進行以下幾個問題的探索和研究(i)在伯氏瘧原

3、蟲探索建立了四環(huán)素誘導基因表達系統(tǒng)(Tetracycline-inducedgeneexpressionsystem，Tet-on);并采用該系統(tǒng)條件性敲除紅內期P.berghei己糖轉運體(HexoseTransporter1，HT1)基因;分析研究了該遺傳致弱性全蟲疫苗的疫苗效能。(ii)研究紅內期P.berghei硫辛酸蛋白連接酶1(Lipoicacidproteinligase1，Lp1A1)基因的功能，并探究可能的代償途徑(i

4、ii)在P.chabaudi中嘗試建立條件性基因敲除系統(tǒng)，比較研究瘧原蟲與宿主細胞之間的相互作用。
　　1.條件性敲除系統(tǒng)的建立及全蟲瘧疾疫苗的研究
　　全蟲瘧疾疫苗被認為是最有效的瘧疾疫苗策略，然而由于現(xiàn)有的瘧疾全蟲疫苗策略存在很多技術上的問題，從而限制了這些全蟲瘧疾疫苗進入臨床研究。在本研究中，我們使用Tet-on系統(tǒng)條件性敲除了紅細胞期P.berghei的必需基因己糖轉運體(HTconditionalknockout，

5、HT-cKO)，分析了HT-cKO瘧原蟲的表型特癥，并研究了HT-cKO致弱性瘧原蟲感染誘導免疫保護力的效果。HT-cKO轉基因瘧原蟲感染小鼠后，在提供無水四環(huán)素(anhydrotetracycline，ATc)的情況下，可以正常增殖和持續(xù)提供大量的轉基因全蟲疫苗;但在不提供ATc的情況下，轉基因瘧原蟲的生長受到嚴重抑制，表現(xiàn)為自滅性感染過程，這些清除了HT-cKO瘧原蟲初次感染的小鼠對野生型瘧原蟲攻擊感染表現(xiàn)出完全的免疫保護力。進一步

6、分析表明，HT-cKO瘧原蟲在小鼠體內連續(xù)傳代未檢測到回復突變，表明該轉基因瘧原蟲是遺傳穩(wěn)定的，具有免疫原性的，同時也可以大規(guī)模培養(yǎng)供給疫苗使用。該研究結果表明，采用條件性敲除系統(tǒng)建立遺傳可控致弱并可誘導理想的免疫保護力的轉基因瘧原蟲是開發(fā)全蟲瘧疾疫苗的一條可行途徑。
　　2.紅內期P.berghei擁有硫辛酸拯救代償途徑
　　硫辛酸是α-酮酸脫氫酶(α-ketoaciddehydrogenase，KADH)多酶復合物和甘氨

7、酸切割系統(tǒng)(GlycineCleavageSystem，GCV)的必需輔因子，這些脫氫酶復合物主要參與能量代謝、脂肪酸生物合成和氨基酸降解。在頂復門微生物的研究中發(fā)現(xiàn)，硫辛酸蛋白連接酶1(LplA1)和硫辛酸蛋白連接酶2(LplA2)催化從環(huán)境中攝取的外源硫辛酸連接到線粒體定位的多酶復合物E2亞單位上，而辛酰載體蛋白(ACP)-N-辛酰轉移酶(octanoyl-[ayclcarrierprotein]:proteinN-octanoyl

8、transferase，LipB)和硫辛酸合成酶A(Lipoicacidsynthase，LipA)是定位在頂復門微生物的頂體中，催化硫辛酸的生物合成，將硫辛酸連接到丙酮酸脫氫酶復合物的硫辛酸結構域。上述硫辛酸蛋白連接酶或合成酶在硫辛酸利用中的功能有初步研究，但在頂復門微生物中的相互關系則尚未闡明。
　　我們利用Tet-on系統(tǒng)條件性敲除了紅內期P.berghei的LplA1基因(LplA1conditionalknockout，

9、LplA1-cKO)并且分析研究了LplA1-cKO瘧原蟲的表型變化和特征。結果表明，在不提供ATc時，LplA1-cKO瘧原蟲在感染的前八天生長被嚴重的抑制，而八天之后轉基因瘧原蟲恢復了生長增殖能力。我們用實時定量PCR分析LplA1基因和LplA2基因的mRNA表達，并發(fā)現(xiàn)，在缺失LplA1的條件下，LplA2代償性增高表達以補償了LplA1的功能。由此得出結論:紅內期P.berghei有選擇性硫辛酸拯救途徑，LplA2可能是Lpl

10、A1的代償基因。
　　3.夏氏瘧原蟲P.chabaudi建立條件性基因敲除系統(tǒng)
　　伯氏瘧原蟲P.berghei在小鼠可引起致死性感染，但夏氏瘧原蟲P.chabaudi感染后，小鼠能清除瘧原蟲的感染。此外，小鼠夏氏瘧原蟲P.chabaudi與人惡性瘧原蟲P.falciparum在許多生物學特征上表現(xiàn)出相似性。我們試圖在P.chabaudi中建立條件性敲除系統(tǒng)，以便將致死型P.berghei和非致死型P.chabaudi兩種瘧