新發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素受體β亞型的研究.pdf

1、甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptors，TRs)屬于核受體超家族的成員，由TRa和TRβ基因編碼。TRa和TRβ基因由于選擇性剪接或轉(zhuǎn)錄起始位置的不同而產(chǎn)生若干同工體(isoform)。主要有TRa1、TRa2、TRa3、TRβ1、TRβ2、TRβ3和截短的TR△α1、TR△α2、TR△β3等。先前本室在大鼠肝臟發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的TRβ的新同工體，它不是又一個(gè)截短的TRβ亞型(例TK△β3)，而是一個(gè)加長(zhǎng)的、帶有一

2、個(gè)超長(zhǎng)的DNA結(jié)合域的新亞型，被命名為TRβ△(不是TR△β)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的外顯子(exon N)。本文對(duì)其進(jìn)行了繼續(xù)研究即其來(lái)源、生成過(guò)程及其若干組織內(nèi)分布；同時(shí)我們又幸運(yùn)的發(fā)現(xiàn)了又一新的同功體TRβ2△。本文將分成三部分?jǐn)⑹觯阂弧Rβ△通過(guò)可變剪接生成的蛋白水平論據(jù)；二、又一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的TRβ同工體(TRβ2△)的研究。三、初步探索核受體超家族中其他成員的DBD區(qū)是否也存在類似的未被發(fā)現(xiàn)的新外顯子。
　　 為了深入了解

3、TRβ△剪接方式在蛋白水平的論據(jù)，我們截取了TRβ基因外顯子3的3’端部分、內(nèi)含子3-4全長(zhǎng)、以及外顯子4的5’端的部分序列共約6.4kb的基因組DNA片段命名為TRβ小基因。以含有上述小基因的質(zhì)粒為模板體外轉(zhuǎn)錄pre-mRNA，再利用體外剪接系統(tǒng)(不同的細(xì)胞系)，進(jìn)行剪接實(shí)驗(yàn)；為了便于檢測(cè)剪切的蛋白產(chǎn)物，在小基因后分別融合了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白和熒光素酶報(bào)告基因，利用定點(diǎn)堿基刪除改造小基因后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)同時(shí)給予T3處理，觀測(cè)剪接、翻

4、譯的變化。RT-PCR顯示：TRβ小基因在多種細(xì)胞系中被成功轉(zhuǎn)錄并剪接成兩種轉(zhuǎn)錄本；蛋白水平檢測(cè)：(1)綠色熒光蛋白檢視陽(yáng)性細(xì)胞率和熒光素酶活性值在剪接形成外顯子3/N/4時(shí)均明顯高于剪接形成外顯子3/4時(shí)；(2)T3處理后，剪接形成外顯子3/N/4時(shí)產(chǎn)生熒光素酶活性值明顯高于無(wú)T3處理組。因此說(shuō)明TRβ小基因在mRNA及蛋白水平均以剪接成為外顯子3/N/4為主，并且該剪接產(chǎn)物受到其配體的正性調(diào)節(jié)。
　　 為了進(jìn)一步了解TRβ△

5、在不同組織的表達(dá)圖式，采用Real-time熒光定量PCR分析TRβ△、TRβ1及TRβ△+TRβ1轉(zhuǎn)錄本在成年大鼠肝、腦、心肌、肺、腎、脾、骨骼肌及睪丸組織中的含量。結(jié)果顯示：除睪丸組織外均可檢測(cè)到TRβ△與TRβ1的表達(dá)，其中心肌表達(dá)量最高，腦組織低表達(dá)，并且各組中TRβ△的表達(dá)量均顯著高于TRB1，并在TRβ1+TRβ△的和值(sum)中占絕大的比例。
　　 利用PCR方法初步探索到垂體中存在TRβ2的新亞型，全長(zhǎng)擴(kuò)增測(cè)序

6、，序列提交Genbank，被命名為TRbeta2Delta(TRβ2△，HM043807.1)。Real-time熒光定量PCR.分析TRβ2△、TRβ2及TRβ2△+TRβ2mRNA在成年大鼠垂體組織中的分布特點(diǎn)，結(jié)果顯示TRβ2及TRβ2△在垂體組織中的表達(dá)水平大致相等而無(wú)明顯差別。將新發(fā)現(xiàn)的TRβ2△ cDNA編碼序列克隆入融合型原核表達(dá)載體pQE-30Xa并進(jìn)行表達(dá)。SDS-PAGE表征表達(dá)產(chǎn)物的分子量和相對(duì)表達(dá)水平，Weste

7、rn-blotting鑒定。TRβ2△融合蛋白的表達(dá)量達(dá)到20.21mg/L培養(yǎng)基。目的蛋白占菌體總蛋白的26.3％。重組蛋白含有6×His標(biāo)簽，經(jīng)Ni-NTA樹(shù)脂親和層析純化的重組蛋白用于放射性配體結(jié)合試驗(yàn)(RLBA)和電泳遷移率改變?cè)囼?yàn)(EMSA)，結(jié)果證實(shí)重組TRβ2△可與T3特異性結(jié)合，Ka為2.3±0.11×109 L/mol；可單獨(dú)或與RXR一起結(jié)合DNA。為了進(jìn)一步證明TRβ2△不僅能夠與其配體及特異性DNA結(jié)合，而且結(jié)合

8、后可調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，我們構(gòu)建了pcDNA3.1/TRβ2△真核表達(dá)載體及含有PAL TRE的pGL3-Promoter報(bào)告基因載體，共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。結(jié)果顯示，T3處理組熒光素酶活性明顯高于無(wú)T3處理組；單獨(dú)轉(zhuǎn)染含PAL TRE的pGL3-Promoter報(bào)告基因載體，由于缺乏與TRE序列結(jié)合的TRβ2△，因此無(wú)論T3存在與否與共轉(zhuǎn)染組相比熒光素酶活性值皆低而無(wú)變化。說(shuō)明TRβ2△與其配體結(jié)合后與TRE結(jié)合促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)

9、一步證明TRβ2△是一個(gè)功能性的TRβ新亞型。
　　 為了探索核受體超家族中其他成員的DBD區(qū)是否也存在類似的未被發(fā)現(xiàn)的新外顯子，本文選擇了糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)、雌激素受體(estrone receptor，ER)、雄激素受體(androgen receptor，AR)、維生素D3受體(vitamin D3 receptor，VDR)四個(gè)核受體超家族中的成員，通過(guò)Genbank分