一個新的棉花矮化突變體基因的精細(xì)定位及功能初步驗(yàn)證.pdf

1、植物矮化是重要的農(nóng)藝性狀。矮化品種具有抗倒伏能力強(qiáng)、適宜密植及機(jī)械化管理等特點(diǎn)，對于減少勞動強(qiáng)度、提高肥料利用率和提高產(chǎn)量具有重要意義，矮化突變體在矮化育種中具有重要的利用價值，同時也是研究植物莖的生長及激素調(diào)控的重要基因資源。棉花具有無限生長習(xí)性，植株高大。當(dāng)前，世界上大多數(shù)產(chǎn)棉國，廣泛采用化學(xué)抑制劑縮節(jié)胺控制棉花生長，使株高普遍控制在90-100cm左右。尤其是自我國新疆“密、矮、早”種植技術(shù)的成功以來，使用化控棉花株高已經(jīng)成為新疆

2、棉花增產(chǎn)的重要措施。但大量噴施化學(xué)抑制劑縮節(jié)胺費(fèi)工費(fèi)事，還帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在世界及我國國民經(jīng)濟(jì)中占重要地位，因此，充分利用自然矮源，選育矮桿品種仍然是提高產(chǎn)量、提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率的重要措施。
　　本課題1998年在一個陸地棉廊坊1號與野生棉黃褐棉雜交選育12世代的材料LHF10中，發(fā)現(xiàn)一個自然矮化突變體，1998-2005年通過自交純化，暫命名“AS98”。本研究建立在前人初定位研究的基礎(chǔ)之上，利用

3、QTL-seq對初定位進(jìn)行驗(yàn)證，測序結(jié)果在D12染色體54Mb-55Mb出現(xiàn)顯著高于閡值的△SNP-mdex值，該區(qū)間包含一個SSR標(biāo)記NAU5204，這與前人構(gòu)建的遺傳連鎖圖上的一個標(biāo)記吻合，證明了測序結(jié)果的可靠性，即D12.54Mb-55Mb可以作為控制AS98矮化基因的候選區(qū)間;
　　隨后我們對候選區(qū)間進(jìn)行SV(Structure Variation)檢測，發(fā)現(xiàn)在給定的候選區(qū)間內(nèi)矮株（突變體）和高株（野生型）存在一個14K大

4、片段的拷貝數(shù)變異(Copy Number Variation，CNV)，為了驗(yàn)證該CNV的存在，我們設(shè)計擴(kuò)增該段的Overlap引物，最終利用兩個端點(diǎn)引物的組合(14k-5F/14k-2R)通過PCR成功的在矮株中擴(kuò)出目的片段而高株中未能擴(kuò)出，為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，我們利用該引物在10個矮株及10個高株中以基因組DNA為模板擴(kuò)增，結(jié)果正如我們的預(yù)期，10個矮株中全部擴(kuò)出，而高株中均未能擴(kuò)出，證明CNV與矮化性狀連鎖。
　　進(jìn)

5、一步研究發(fā)現(xiàn)該CNV內(nèi)包含一個基因EXTR-DWARF，我們從CottonFGD網(wǎng)站上獲得該基因的序列并利用NCBI網(wǎng)站的Prmer Desigin功能設(shè)計該基因的全長引物，分別以矮株、半矮株、高株的基因組DNA為模板克隆該基因，測序結(jié)果顯示該基因在三種表型不一的植株中序列完全相同，隨后矮株和高株中qRT-PCR結(jié)果顯示該基因在突變體及野生型的表達(dá)量存在極顯著差異;
　　為了進(jìn)一步確定該基因就是控制AS98植株矮化的候選基因，經(jīng)V

6、IGS(Virus Induced Gene Silencing，病毒誘導(dǎo)的基因沉默)試驗(yàn)接種沉默該基因的病毒的矮化植株能夠恢復(fù)株高至野生型高度，這也證明了該基因有很大的可能是與AS98植株矮化相關(guān)基因。
　　本研究所用材料表現(xiàn)為極端矮化，是研究植物矮化機(jī)理的資源材料，本實(shí)驗(yàn)通過QTL-seq方法獲得矮化相關(guān)位點(diǎn)信號區(qū)域，并利用二代測序獲得的mapping reads鑒定到該區(qū)域內(nèi)一個與矮化性狀高度連鎖的CNV標(biāo)記，該標(biāo)記中所攜帶