刺老苞根皮對(duì)骨愈合作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景
　　 骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)修復(fù)過程,受到諸多因素的影響,如何促進(jìn)骨折修復(fù)、加快骨折愈合的速度一直是骨傷科領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。
　　 近年來,國內(nèi)外學(xué)者通過現(xiàn)代研究手段從多方面、多角度對(duì)一些單味草藥、復(fù)方及其有效成分進(jìn)行研究,證實(shí)草藥在改善血液循環(huán),促進(jìn)鈣鹽沉積,提高骨痂生物力學(xué)性能、成骨細(xì)胞活性、微量元素含量及刺激骨生長(zhǎng)因子分泌與合成等方面均對(duì)骨折愈合有良好的影響,這些研究為臨床用藥提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2、
　　 刺老苞根皮是土家族民間醫(yī)藥中常用草藥,為五加科惚木屬刺莖檧木(AraliaechinocaulisHand-Mazz.)之根皮,當(dāng)?shù)亓?xí)稱“紅槐木”,又名“紅刺根”、“紅鵲不踏”等。其有效化學(xué)成分主要包括檧木皂苷A、C、G,檧木皂苷甲酯,齊墩果酸-25-O-β-D-呲喃葡萄糖苷,黃酮類化合物、揮發(fā)油等類化合物單體,功能滋陰健腎、祛風(fēng)濕、壯筋骨、散瘀血、消腫毒,廣泛用于治療跌打損傷、骨折、風(fēng)濕痹痛等,有較好的消腫止痛、促進(jìn)傷

3、裂骨折愈合的功效,還可用于治療骨髓炎、骨質(zhì)增生、上消化道疾病及水腫虛腫等,常單方鮮用或配伍其他藥物共同使用?！冬F(xiàn)代醫(yī)藥大辭典》及《土家族醫(yī)藥學(xué)概論》中均有記載,但本品單方水提物對(duì)骨折愈合作用如何及對(duì)其作用機(jī)制的研究目前尚無報(bào)道。
　　 本課題的前期研究初步證實(shí):刺老苞根皮水提物中總黃酮含量為0.92％,微量元素豐富,含量較多的是Ca,Mg,Se,Ga,Cu,和Zn,尤其是Cu,Ca,Se元素的含量高過同類中草藥10多倍?？傸S酮能

4、使SOD活性加快,擴(kuò)張微血管,增加血流量,改善微循環(huán),調(diào)控成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞代謝,對(duì)骨折愈合、血管再生有促進(jìn)作用。豐富的微量元素可作為藥物中有機(jī)成分的中心原子,利于藥物有效成分的合成和作用。
　　 目的
　　 為進(jìn)一步明確該藥在骨折愈合過程中的作用機(jī)制,本課題對(duì)刺老苞根皮水提物有效成分作更深一步研究,通過整體、細(xì)胞、分子不同水平的系統(tǒng)探討該藥物對(duì)骨折愈合的作用及機(jī)理。研究?jī)?nèi)容與方法
　　 1、建立模型及給藥:

5、r>　　 350只SPF級(jí)健康雌性大鼠隨機(jī)分為7組,分別為刺老苞根皮水提物高、中、低劑量組,西藥陽性對(duì)照藥左旋多巴組、中藥陽性對(duì)照藥傷科接骨片組,模型組及空白組。除空白組外其余動(dòng)物均建立脛骨骨折模型,于雙側(cè)脛骨結(jié)節(jié)下端2mm處自外側(cè)向內(nèi)側(cè)打孔,直徑1mm,鉆透皮質(zhì)深達(dá)髓腔,不觸及對(duì)側(cè)皮質(zhì)。造模后當(dāng)日灌服給藥,空白組及模型組灌服等體積蒸餾水。分別于術(shù)后4d,7d,14d,21d,28d取材,心臟采血,取雙側(cè)脛骨。
　　 2、觀察

6、指標(biāo):
　　 ①組織形態(tài)學(xué):采用蘇木素-伊紅(H&E)染色。
　　 ②骨修復(fù)相關(guān)生化指標(biāo):采用放射免疫分析試劑盒測(cè)定血清堿性磷酸酶活性,血清骨鈣素及血清羥脯氨酸含量。
　　 ③骨生物力學(xué)指標(biāo):采用千分尺測(cè)量所測(cè)骨的長(zhǎng)度、采用分析天平稱量?jī)蓚?cè)骨的重量、采用QTS-25型流變儀測(cè)量骨最大載荷和功；骨膠原蛋白采用ICP—MS全自動(dòng)生化儀檢測(cè)；骨密度采用Lunar-XR雙能X線骨密度儀測(cè)定。X線片評(píng)價(jià)骨痂生長(zhǎng)情況。

7、>　　 ④骨礦物元素含量:ICP-MS全自動(dòng)生化儀檢測(cè)骨中鋅、鎂、銅、錳、鈣、磷等微量元素含量。
　　 ⑤對(duì)骨修復(fù)相關(guān)因子受體表達(dá)的影響:免疫組化方法分析刺老苞根皮水提物有效成分對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體1(TGF-βR1)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(FGFR2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1,2(Flt-1,Flk-1)表達(dá)的相關(guān)性及刺老苞根皮水提物有效成分對(duì)上述細(xì)胞因子受體表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果
　　 1、組織形態(tài)學(xué)觀

8、察到:刺老苞根皮不同劑量組骨組織愈合較模型組快,以高、中劑量組更為顯著。特點(diǎn)為血腫吸收、機(jī)化、血管內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞增生迅速,骨內(nèi)膜成骨細(xì)胞增殖明顯,新骨改建快,提前于模型組進(jìn)入骨重建期。修復(fù)速度與陽性對(duì)照組相近。
　　 2、骨修復(fù)相關(guān)生化指標(biāo)觀察到:刺老苞根皮不同劑量組與模型組比較血清堿性磷酸酶活性升高,血清骨鈣素、羥脯氨酸含量增加,以高、中劑量組更為顯著。
　　 3、骨生物力學(xué)指標(biāo)觀察到:刺老苞根皮不同劑量組與模型

9、組比較骨長(zhǎng)度、骨重量、骨密度、最大載荷和功均有所增加,骨膠原蛋白含量增高,X線片顯示骨痂生長(zhǎng)情況優(yōu)于模型組,以高、中劑量組尤為顯著,表現(xiàn)與陽性對(duì)照組相近。
　　 4、骨礦物元素含量檢測(cè)顯示:刺老苞根皮不同劑量組骨微量元素鈣、磷、鎂、銅、硒、錳含量均高于模型組,以高、中劑量組更為顯著。
　　 5、免疫組化結(jié)果顯示:
　　 ①刺老苞根皮高、中劑量組在骨愈合中、后期能顯著提高TGF-βR1的表達(dá)水平,3組數(shù)值上均高于模

10、型組,高劑量組更為顯著,TGF-βR1表達(dá)量的增高意味著結(jié)合更多TGF-β以發(fā)揮調(diào)控作用,作為骨形成和骨吸收之間重要的偶聯(lián)調(diào)節(jié)因子,TGF-β既促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成、刺激骨吸收,又促進(jìn)成骨細(xì)胞分化增殖、產(chǎn)生骨基質(zhì),加快骨形成,發(fā)揮著雙重調(diào)節(jié)作用,并能夠增加成骨細(xì)胞定向遷移的能力。
　　 ②刺老苞根皮高劑量組在骨愈合中期至觀察期末顯著提高FGFR2的陽性表達(dá),FGFR2相應(yīng)的高表達(dá)使FGF將更多信號(hào)傳遞給骨生成細(xì)胞,在促進(jìn)成纖維細(xì)胞

11、有絲分裂、成骨細(xì)胞增殖分化、軟骨細(xì)胞增殖分化及血管新生等方面發(fā)揮積極作用。
　　 ③刺老苞根皮不同劑量組在骨愈合軟骨骨痂形成及軟骨形成階段顯著上調(diào)Flt-1、Flk-1的表達(dá)水平,以高、中劑量組更為顯著,此時(shí)段是骨愈合血管重建的關(guān)鍵時(shí)期,表明其在骨修復(fù)和血管重建的過程起到了積極作用。
　　 結(jié)論
　　 1、刺老苞根皮在骨愈合過程中能刺激骨生成細(xì)胞增殖分化,縮短骨痂形成時(shí)間,使骨修復(fù)提前進(jìn)入重建期。
　　

12、2、刺老苞根皮在骨愈合過程中補(bǔ)充骨修復(fù)所需的鋅、鎂、銅、錳、鈣、磷等微量元素,提高血清堿性磷酸酶活性及骨鈣素、羥脯氨酸的含量,加速骨基質(zhì)礦化。
　　 3、刺老苞根皮在骨愈合過程中增加骨痂的力學(xué)性能及損傷處骨密度和骨生物力學(xué)強(qiáng)度,提高骨愈合質(zhì)量。
　　 4、刺老苞根皮在骨愈合過程中不同程度的提高了骨損傷處轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體1(TGF-βR1)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(FGFR2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1,2(Flt-1,F