成纖維細(xì)胞生長因子結(jié)合蛋白對皮膚源祖細(xì)胞體外擴(kuò)增及體內(nèi)歸巢的影響.pdf

1、隨著組織工程的發(fā)展，重建皮膚逐漸成為解決大面積燒傷自體皮源不足這一難題的途徑之一。國內(nèi)外的許多研究者致力于尋找合適的種子細(xì)胞與具備一定皮膚組織結(jié)構(gòu)的真皮支架構(gòu)建組織工程皮膚進(jìn)行復(fù)合移植，用于治療全層皮膚缺損和深度燒傷。 本課題組于2000年開始系統(tǒng)研究組織工程皮膚的構(gòu)建，成功地分離出皮膚源祖細(xì)胞，構(gòu)建血漿真皮再生模板，并將皮膚源祖細(xì)胞復(fù)合血漿真皮再生模板構(gòu)建人工皮膚；構(gòu)建皮膚源祖細(xì)胞一透明質(zhì)酸復(fù)合物應(yīng)用于糖尿病大鼠的皮膚缺損創(chuàng)面

2、的修復(fù)，取得了一定成果。組織工程皮膚種子細(xì)胞的研究應(yīng)進(jìn)一步深入，并且要解決以下問題：①提高種子細(xì)胞的增殖活性；②種子細(xì)胞的安全性；③種子細(xì)胞修復(fù)創(chuàng)面的機(jī)制。 成纖維細(xì)胞生長因子結(jié)合蛋白(FGF-BP)是近年來發(fā)現(xiàn)的FGF家族的載體蛋白，尤其對堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)作用明顯。FGF-BP通過激活FGF，使其參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖分裂、創(chuàng)面修復(fù)及腫瘤生長等生理病理過程。FGF-BP在FGF正常發(fā)揮生物學(xué)活性的過程中起著重

3、要作用，并被稱為腫瘤形成的“限速者”和血管形成的“開關(guān)”。 因此，本課題通過在細(xì)胞培養(yǎng)過程中引入FGF-BP，觀察其對皮膚源祖細(xì)胞體外增殖，安全性的影響；觀察其對皮膚源祖細(xì)胞體內(nèi)動員、遷移以修復(fù)創(chuàng)面的作用。 第一部分：皮膚源祖細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 目的：分離、純化皮膚源祖細(xì)胞，觀察其體外培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性，為創(chuàng)面修復(fù)的細(xì)胞治療提供理想的細(xì)胞源。 方法：取出生1～3天的昆明乳鼠的皮膚，消化分離皮膚源祖細(xì)胞，在

4、含表皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)、傳代，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)；檢測細(xì)胞周期；分別用免疫熒光方法和流式細(xì)胞儀方法檢測細(xì)胞胞內(nèi)抗原Fibronectin、Nestin、GFAP和NSE及細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD71、CD34、CD49f的表達(dá)。 結(jié)果：細(xì)胞懸浮生長，形成克隆球團(tuán)；細(xì)胞純化后的細(xì)胞周期G0／G1為(90.433±1.504)％；細(xì)胞免疫熒光顯示細(xì)胞表達(dá)Nestin和Fibronectin陽性；

5、流式細(xì)胞儀檢測Nestin表達(dá)占(4.44±0.233)％，F(xiàn)ibronectin表達(dá)占(8.44±0.564)％，GFAP表達(dá)占(4.0±0.350)％，NSE表達(dá)占(51.5±0.278)％；細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29強(qiáng)陽性，占(98.9±0.361)％，CD34陽性，占(87.567±1.341)％，CD49f與CD71弱陽性，分別為(4.233±0.874)％，(39.8±1.136)％。 結(jié)論：所培養(yǎng)的細(xì)胞為皮膚源祖細(xì)胞，

6、它處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，具有高度的分化潛能和很強(qiáng)的增殖能力。 第二部分：成纖維細(xì)胞生長因子結(jié)合蛋白對皮膚源祖細(xì)胞體外增殖和端粒酶活性的影響 目的：在皮膚源祖細(xì)胞培養(yǎng)過程中，加入FGF-BP這一干預(yù)因素，觀察其對細(xì)胞增殖性及安全性的影響。 方法：為了探討FGF-BP對細(xì)胞增殖的影響，將已純化的皮膚源祖細(xì)胞進(jìn)行分組，分別在培養(yǎng)基中加入0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng／ml梯度濃度的FGF-BP，用CC

7、K-8試劑盒篩選FGF-BP對皮膚源祖細(xì)胞的最大作用濃度；以有無加入FGF-BP最大作用濃度培養(yǎng)細(xì)胞分為FG：F-BP(+)和FGF-BP(-)兩組，進(jìn)行繪制生長曲線、端粒酶活性測定、染色體核型分析及細(xì)胞胞內(nèi)、表面標(biāo)記物測定，比較兩組之間的差異；觀察兩組細(xì)胞成脂誘導(dǎo)差異。 結(jié)果：在含堿性成纖維細(xì)胞生長因子和表皮生長因子的培養(yǎng)基中加入10ng／ml的FGF-BP對細(xì)胞增殖的作用最大。FGF-BP對于皮膚源祖細(xì)胞的作用呈雙向性，在0

8、～10ng／ml濃度區(qū)間FGF-BP與皮膚源祖細(xì)胞增殖之間呈劑量依賴關(guān)系，在10～1000ng／ml濃度區(qū)間隨FGF-BP濃度增加，皮膚源祖細(xì)胞的增殖活性降低；FGF-BP(+)組細(xì)胞生長增殖速度快于FGF-BP(-)組；FGF-BP(+)組細(xì)胞端粒酶活性下降速度慢于FGF-BP(-)組，P<0.05；細(xì)胞周期測定FGF-BP(+)細(xì)胞G0／G1所占百分比為(80.400±0.656)％；FGF-BP(-)細(xì)胞G0/G1所占百分比為(8

9、1.967±0.208)％，兩組細(xì)胞之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；兩組細(xì)胞正常二倍體核型，細(xì)胞染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)正常，未見缺失、易位、斷裂等畸形；FGF-BP(+)組細(xì)胞胞內(nèi)抗原Fibronectin表達(dá)占(2.5±0.259)％，Nestin表達(dá)占(1.7±0.388)％，GFAP表達(dá)占(1.5±0.908)％，NSE表達(dá)占(17.4±0.290)％；FGF-BP(-)組細(xì)胞胞內(nèi)抗原Fibronectin表達(dá)占(3.4±0.318)％，Nesti

10、n表達(dá)占(1.5±0.616)％，GFAP表達(dá)占(1.0±0.369)％，NSE表達(dá)占(16.3±0.260)％；皮膚源祖細(xì)胞克隆球團(tuán)細(xì)胞表面分子表達(dá)，F(xiàn)GF-BP(+)細(xì)胞CD29占(81.6±0.216)％，CD71占(93.2±0.233)％，CD49f占(30.1±0.565)％，CD34為(90.3±0.282)％；FGF-BP(-)細(xì)胞CD29占(72.6±0.213)％，CD71占(91.0±0.239)％，CD49f占(

11、34.4±0.1 90)％，CD34為(92.3±0.284)％，兩組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；兩組細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后油紅0染色均為陽性。 結(jié)論：在細(xì)胞培養(yǎng)基中引入FGF-BP，提高了堿性成纖維細(xì)胞生長因子促皮膚源祖細(xì)胞增殖的作用；FGF-BP在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖過程中起雙向作用；延緩了皮膚源祖細(xì)胞端粒酶活性的降低速度，但未見影響皮膚源祖細(xì)胞的細(xì)胞周期、染色體核型及多向分化潛能，為皮膚源祖細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究提供安全方面的理論依

12、據(jù)。 第三部分：FGF-BP對皮膚源祖細(xì)胞修復(fù)創(chuàng)面及體內(nèi)歸巢的作用 目的：探討皮膚源祖細(xì)胞在創(chuàng)面愈合過程中的歸巢功能及FGF-BP在細(xì)胞歸巢和創(chuàng)面愈合中所起的作用。 方法：40只昆明鼠隨機(jī)分為FGF-BP(+)組(A組)、FGF-BP(-)組(B組)、對照組(C組)和未處理組(D組)，對前三組細(xì)胞昆明鼠背部制作1個(gè)直徑大小為1.0cm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面，A、B、D組分別尾靜脈緩慢注射用CM—DiI標(biāo)記過的皮膚

13、源祖細(xì)胞懸液0.1ml，C組尾靜脈注射等量生理鹽水；A組創(chuàng)緣微量注射FGF-BP(10ng／ml，0.5ml)，B、C組分別在創(chuàng)緣注射等量生理鹽水。觀察A、B、C組創(chuàng)面收縮率、組織形態(tài)學(xué)、微血管的改變；觀察A、B、D組皮膚源祖細(xì)胞體內(nèi)動員遷移情況；將FGF-BP(+)、FGF-BP(-)兩組細(xì)胞接種于裸鼠皮下進(jìn)行成瘤性實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果：各組1w、2w時(shí)創(chuàng)面收縮明顯，滲液少，創(chuàng)緣可見新生上皮長出，兩細(xì)胞移植組表皮層略厚于對照組；1w、

14、2w時(shí)A組與B組創(chuàng)面收縮率顯著高于對照組(P<0.05)，1w、2w時(shí)A組創(chuàng)面收縮率亦明顯高于B組(P<0.05)；1w、2w時(shí)A組與B組創(chuàng)面微血管形成數(shù)目顯著高于對照組(P<0.05)；1w時(shí)A組創(chuàng)面微血管數(shù)目明顯高于B組，而2w時(shí)，兩組之間差異不明顯，微血管數(shù)目相近(P>0.05)；移植1w后，冰凍切片可見在背部創(chuàng)面處及其周邊部位出現(xiàn)CM-Dil標(biāo)記皮膚源祖細(xì)胞，在該組小鼠遠(yuǎn)離創(chuàng)面的正常皮膚和D組小鼠皮膚CM-Dil標(biāo)記的移植細(xì)胞較

15、少。A組可見細(xì)胞遷移至皮膚全層，包括毛囊乳頭處，CM-Dil標(biāo)記的移植細(xì)胞密度為41.75±3.594個(gè)／mm2，與B、D組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2w時(shí)標(biāo)記的移植細(xì)胞密度為141±7.616個(gè)／mm2，與B、D組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，移植細(xì)胞還分布于各組小鼠肺臟、脊髓和肝臟，但脾、腎、心肌、腦未見移植細(xì)胞；裸鼠成瘤性實(shí)驗(yàn)示注射局部無紅腫、包塊，病理組織檢查未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞和組織異常。 結(jié)論：FGF-BP“