CIP2A在genistein和lapatinib抗乳腺癌中的作用.pdf

1、本文主要從以下幾個方面展開論述：
　　第一部分 Genistein作用乳腺癌細胞后CIP2A表達變化
　　目的：
　　檢測genistein作用于乳腺癌細胞MCF-7、MCF-7-C3和T47D后CIP2A的蛋白水平表達，以及genistein對乳腺癌細胞的生長抑制和凋亡活動的影響。
　　方法：
　　1.選用實驗室構(gòu)建的Caspase3穩(wěn)定表達的MCF-7/ Caspase3（MCF-7-C3）細胞株，We

2、stern blot檢測經(jīng)不同濃度genistein處理后乳腺癌細胞MCF-7、MCF-7-C3和T47D中的CIP2A、PARP/cleaved PARP、caspase-3、cleaved caspase-3的表達水平變化。
　　2.采用 MTT比色分析法檢測不同濃度 genistein(0μM，5μM，10μM，20μM，40μM，60μM)對乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D增殖的影響。
　　3.用流式細胞儀分析g

3、enistein處理乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D前后對細胞周期分布的影響。
　　結(jié)果：
　　1.Genistein對乳腺癌細胞MCF-7、MCF-7-C3和T47D中的CIP2A蛋白表達有下調(diào)的作用，且隨著genistein濃度的升高，對CIP2A蛋白的下調(diào)作用增強;通過western blot檢測凋亡蛋白表達水平顯示，genistein可以引起明顯的凋亡活動，減少總caspase-3蛋白水平的表達，增加caspas

4、e-3和PARP的切割帶產(chǎn)生。提示genistein誘導(dǎo)的CIP2A下調(diào)與總caspase-3水平的下降、caspase-3和PARP的切割帶升高有關(guān)，即genistein介導(dǎo)的CIP2A蛋白水平的下調(diào)與其誘導(dǎo)的乳腺癌細胞凋亡活動有關(guān)。
　　2.MTT結(jié)果顯示，genisten（＞10μM）對乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D有生長抑制作用，且呈濃度依賴性。
　　結(jié)論：
　　Genistein可以下調(diào)癌基因CIP2A

5、的蛋白表達，其介導(dǎo)的CIP2A下調(diào)活動可能與genistein誘導(dǎo)的乳腺癌細胞生長抑制和凋亡活動發(fā)生有關(guān)。
　　第二部分 CIP2A過表達減弱乳腺癌細胞對genistein的敏感性
　　目的：
　　為了研究CIP2A過表達是否減弱乳腺癌細胞對genistein的藥物敏感性，即CIP2A過表達減弱genistein誘導(dǎo)的乳腺癌細胞生長抑制活動和凋亡的發(fā)生。
　　方法：
　　1.用CIP2A過表達編碼的慢病毒分

6、別感染乳腺癌細胞株MCF-7-C3和T47D,對照組感染空載質(zhì)粒。經(jīng)篩選后獲得穩(wěn)定混合克隆細胞株，經(jīng)Western blot檢測，對各個穩(wěn)定克隆細胞株CIP2A蛋白的表達情況進行鑒定。
　　2.MTT檢測genistein對穩(wěn)定克隆細胞株MCF-7-C3/CIP2A、T47D/CIP2A和各對照組細胞增殖的影響。
　　3.流式細胞儀檢測genistein對穩(wěn)定克隆細胞株MCF-7-C3/CIP2A、T47D/CIP2A和各對

7、照組細胞的細胞周期分布的影響。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)過篩選和Western blot鑒定，獲得穩(wěn)定CIP2A過表達的乳腺癌細胞株MCF-7-C3和T47D，分別命名為MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A細胞。
　　2.MTT細胞增殖實驗結(jié)果顯示，穩(wěn)定克隆細胞株MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A經(jīng)過genistein不同濃度(0μM，5.μM，10μM，20μM，40μM，60μM)處理5

8、天后，與各自的對照組細胞相比，genistein對CIP2A過表達乳腺癌細胞MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A的生長抑制作用明顯減弱。
　　結(jié)論：
　　CIP2A過表達減弱genistein介導(dǎo)的乳腺癌細胞生長抑制和凋亡活動的發(fā)生。
　　第三部分 CIP2A沉默促進乳腺癌細胞對genistein的敏感性
　　目的：
　　為了研究CIP2A沉默是否增加genistein的藥物敏感性，即CIP2

9、A沉默增強genistein誘導(dǎo)的乳腺癌細胞生長抑制和凋亡的發(fā)生。
　　方法：
　　1.實驗中采用CIP2A shRNA編碼的慢病毒感染MCF-7-C3和T47D細胞，對照組感染空載質(zhì)粒。Western blot檢測篩選后的穩(wěn)定克隆細胞株在CIP2A蛋白水平的表達。
　　2.MTT細胞增殖實驗結(jié)果顯示，穩(wěn)定克隆細胞株MCF-7-C3/siCIP2A和T47D/siCIP2A經(jīng)過genistein不同濃度處理5天后，與各

10、自對應(yīng)的對照組相比，genistein對MCF-7-C3/siCIP2A、T47D/siCIP2A乳腺癌細胞的生長抑制作用增加。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)過puromyein篩選和Western blot鑒定，獲得穩(wěn)定CIP2A沉默細胞株MCF-7-C3和T47D，分別命名為MCF-7-C3/siCIP2A和T47D/siCIP2A。
　　2.MTT比色分析結(jié)果顯示，穩(wěn)定克隆細胞MCF-7-C3/siCIP2A、T47D

11、/siCIP2A經(jīng)genistein處理5天后，與對應(yīng)的對照組相比，genistein促進了CIP2A沉默細胞株MCF-7-C3/siCIP2A和T47D/siCIP2A的生長抑制。
　　結(jié)論：
　　CIP2A沉默的乳腺癌細胞增加了genistein介導(dǎo)的乳腺癌細胞生長抑制和凋亡活動的發(fā)生。
　　第四部分 Genistein誘導(dǎo)CIP2A下調(diào)的分子機制
　　目的：
　　從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白酶體通路水平探討gen

12、istein下調(diào)CIP2A的作用機制。
　　方法：
　　1.Genistein處理乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D后，采用實時熒光定量PCR技術(shù)分析genistein對乳腺癌細胞的CIP2A mRNA水平的調(diào)節(jié)。
　　2.Genistein處理乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D細胞后，合并或不合并蛋白酶體抑制劑MG132繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后采用Western blot分析對CIP2A蛋白表達水平的影響。
　

13、　3.由于CIP2A蛋白的穩(wěn)定性受到Akt活性的調(diào)節(jié)，我們在實驗中用genistein處理乳腺癌細胞后，采用Western blot檢測乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D在p-Akt的蛋白水平變化;E2F1是調(diào)控CIP2A轉(zhuǎn)錄水平變化的一個重要轉(zhuǎn)錄因子，在實驗中我們用genistein處理乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D后，用Western blot檢測了E2F1的蛋白表達水平變化，旨在研究E2F1在genistein介導(dǎo)的CIP

14、2A轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，在乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D中用25μM或50μM genistein處理過后的CIP2A的mRNA水平明顯下降;且在低濃度的genistein處理后的乳腺癌細胞中CIP2A的mRNA水平有了輕度的升高。這種劑量依賴式模式變化與我們前面研究的genistein對CIP2A在蛋白水平變化相一致。
　　2.Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)

15、經(jīng)過用蛋白酶抑制劑MG132處理后的細胞可以明顯逆轉(zhuǎn)genistein所誘導(dǎo)的CIP2A在蛋白水平的下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　Genistein誘導(dǎo)的CIP2A轉(zhuǎn)錄水平的抑制與CIP2A的蛋白水平下調(diào)有關(guān)且受到蛋白酶體通路的調(diào)節(jié);genistein誘導(dǎo)的CIP2A在蛋白水平發(fā)生的下調(diào)導(dǎo)致乳腺癌細胞中Akt的活性受到抑制;轉(zhuǎn)錄因子E2F1在genistein誘導(dǎo)的CIP2AmRNA水平下調(diào)中起關(guān)鍵作用，這一變化導(dǎo)致了整個CIP2

16、A在蛋白水平的下調(diào)。
　　第五部分 CIP2A調(diào)節(jié)在lapatinib耐藥細胞中的作用
　　目的：
　　檢測CIP2A沉默后BT474/LR細胞對lapatinib的敏感性變化，探討CIP2A在lapatinib耐藥性(LR)乳腺癌細胞中的作用，
　　方法：
　　1.采用本實驗室已建好的lapatinib耐藥細胞株BT474/LR，用MTT比色分析驗證BT474和BT474/LR乳腺癌細胞對lapatini

17、b的不同敏感性。
　　2.分析lapatinib對乳腺癌細胞BT474和BT474/LR中CIP2A蛋白表達水平的影響。
　　3.以CIP2A shRNA編碼的慢病毒感染BT47/LR細胞，篩選和建立有效CIP2A沉默的穩(wěn)定克隆細胞株BT474/LR/siCIP2A。
　　結(jié)果：
　　1.用lapatinib處理乳腺癌細胞BT474和BT474/LR后，MTT比色分析結(jié)果顯示BT474/LR細胞對抗lapatin

18、ib誘導(dǎo)的生長抑制。
　　2.Western blot結(jié)果顯示，BT474和BT474/LR細胞經(jīng)lapatinib處理后，BT474/LR細胞對抗lapatinib誘導(dǎo)CIP2A下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　CIP2A沉默增強BT474/LR細胞株對lapatinib的敏感性，也增加lapatinib誘導(dǎo)的生長抑制和凋亡活動，其誘導(dǎo)機制可能與CIP2A沉默后增加lapatinib對BT474/LR細胞中Akt活性的抑制相關(guān)