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文檔簡介
1、【目的】1.分離、培養(yǎng)擴增和鑒定豬BMSCs。2.構(gòu)建TGF-β1重組慢病毒表達載體,并轉(zhuǎn)染BMSCs,為骨軟骨組織工程修復提供持續(xù)高效的種子細胞。3.制備膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基磷灰石支架材料并檢測其生物相容性。
【方法】1.分離、培養(yǎng)擴增和鑒定豬BMSCs:聯(lián)合應用密度梯度離心法及貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)擴增豬BMSCs,并應用流式細胞儀鑒定BMSCs表面相對特異性分子(CD90、CD105、CD45)的陽性率以明確B
2、MSCs的純度。2.構(gòu)建TGF-β1重組慢病毒表達載體,并轉(zhuǎn)染BMSCs:將已提取的目的基因TGF-β1cDNA包裝至慢病毒載體中,通過PCR及基因測序?qū)﹃栃钥寺∵M行鑒定,并用Real-time PCR檢測慢病毒滴度;利用TGF-β1重組慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs,通過Western blot、RT-PCR,免疫細胞化學、Elisa等方法檢測TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表達情況,以明確轉(zhuǎn)染效果。3. 制備膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基
3、磷灰石支架材料并檢測其生物相容性:由清華大學研發(fā)和制備出膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基磷灰石支架材料,并依據(jù)相關(guān)標準選擇急性全身毒性試驗、皮內(nèi)刺激試驗、熱原試驗、溶血試驗、體外細胞毒性試驗及骨植入試驗檢測膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基磷灰石支架材料的生物相容性。
【結(jié)果】1.聯(lián)合應用密度梯度離心法及貼壁培養(yǎng)法成功分離、培養(yǎng)擴增豬BMSCs,流式細胞儀檢測細胞表面相對特異性分子的陽性表達率顯示:CD90為91.2%,CD105為
4、93.5%,CD45為4.4%。2.經(jīng)PCR及基因測序鑒定TGF-β1重組慢病毒表達載體構(gòu)建成功,測定滴度為2×109TU/ml;以慢病毒為載體,將TGF-β1基因?qū)胴iBMSCs,經(jīng)Western blot、RT-PCR、免疫細胞化學及Elisa提示TGF-β1基因成功導入BMSCs,并表達TGF-β1蛋白。3. 膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基磷灰石支架材料的急性全身毒性試驗、皮內(nèi)刺激試驗、熱原試驗、溶血試驗、體外細胞毒性試驗均符合相關(guān)
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