膠原-殼聚糖-膠原-納米羥基磷灰石仿生支架復合BMSCs體外構(gòu)建組織工程骨軟骨的前期實驗研究.pdf

1、【目的】1．分離、培養(yǎng)擴增和鑒定豬BMSCs。2．構(gòu)建TGF-β1重組慢病毒表達載體，并轉(zhuǎn)染BMSCs，為骨軟骨組織工程修復提供持續(xù)高效的種子細胞。3.制備膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基磷灰石支架材料并檢測其生物相容性。
　　 【方法】1．分離、培養(yǎng)擴增和鑒定豬BMSCs：聯(lián)合應用密度梯度離心法及貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)擴增豬BMSCs，并應用流式細胞儀鑒定BMSCs表面相對特異性分子(CD90、CD105、CD45）的陽性率以明確B

2、MSCs的純度。2．構(gòu)建TGF-β1重組慢病毒表達載體，并轉(zhuǎn)染BMSCs：將已提取的目的基因TGF-β1cDNA包裝至慢病毒載體中，通過PCR及基因測序?qū)﹃栃钥寺∵M行鑒定，并用Real-time PCR檢測慢病毒滴度；利用TGF-β1重組慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，通過Western blot、RT-PCR，免疫細胞化學、Elisa等方法檢測TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表達情況，以明確轉(zhuǎn)染效果。3. 制備膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基

3、磷灰石支架材料并檢測其生物相容性：由清華大學研發(fā)和制備出膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基磷灰石支架材料，并依據(jù)相關(guān)標準選擇急性全身毒性試驗、皮內(nèi)刺激試驗、熱原試驗、溶血試驗、體外細胞毒性試驗及骨植入試驗檢測膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基磷灰石支架材料的生物相容性。
　　 【結(jié)果】1.聯(lián)合應用密度梯度離心法及貼壁培養(yǎng)法成功分離、培養(yǎng)擴增豬BMSCs，流式細胞儀檢測細胞表面相對特異性分子的陽性表達率顯示：CD90為91.2％，CD105為

4、93.5％，CD45為4.4％。2.經(jīng)PCR及基因測序鑒定TGF-β1重組慢病毒表達載體構(gòu)建成功，測定滴度為2×109TU/ml；以慢病毒為載體，將TGF-β1基因?qū)胴iBMSCs，經(jīng)Western blot、RT-PCR、免疫細胞化學及Elisa提示TGF-β1基因成功導入BMSCs，并表達TGF-β1蛋白。3. 膠原-殼聚糖/膠原-納米羥基磷灰石支架材料的急性全身毒性試驗、皮內(nèi)刺激試驗、熱原試驗、溶血試驗、體外細胞毒性試驗均符合相關(guān)