基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的非酒精性脂肪性肝病脂質(zhì)貯積機(jī)制研究.pdf

1、近年來，隨著生活生平的提高和生活習(xí)慣的改變，非酒精性脂肪性肝?。∟onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的患病率逐年升高，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。NAFLD的疾病譜包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎及其相關(guān)肝硬化、肝細(xì)胞肝癌等。NAFLD的發(fā)生發(fā)展與肥胖、2型糖尿病、高血壓等代謝性疾病關(guān)系密切，是遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病，但其確切的發(fā)病機(jī)制并未明確。經(jīng)典的“二次打擊”學(xué)說并不能完全解釋NAFLD

2、的全部機(jī)制。NAFLD的發(fā)生是肝細(xì)胞不斷貯積脂質(zhì)的過程，從肝細(xì)胞脂質(zhì)貯積的分子機(jī)制入手，將為NAFLD的發(fā)病機(jī)制研究提供新線索。
　　肝細(xì)胞脂質(zhì)貯積主要與脂質(zhì)攝取、合成、分泌以及氧化清除相關(guān)。微囊蛋白1(Caveolin-1)是微囊的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是一個(gè)多功能的信號(hào)蛋白。結(jié)合文獻(xiàn)閱讀和前期研究，我們推測(cè)caveolin-1的表達(dá)缺失可能通過增加脂肪酸攝取與合成，促進(jìn)脂質(zhì)貯積、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，加速NAFLD的發(fā)生發(fā)展。我們利用NAF

3、LD小鼠和細(xì)胞模型，應(yīng)用最新的基因編輯技術(shù)--CRISRP/Cas9系統(tǒng)以及重組慢病毒技術(shù)，干預(yù)caveolin-1表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn):caveolin-1的表達(dá)與肝臟脂肪變性程度相關(guān)，caveolin-1的表達(dá)缺失，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性加重、脂質(zhì)貯積增加，脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白(SREBP-1、FASN、ACC)表達(dá)上調(diào)，炎癥因子COX-2表達(dá)增加，因此，caveolin-1可能是NAFLD發(fā)生的保護(hù)因子。
　　蛋白質(zhì)的泛素化修飾與降解，是

4、維護(hù)脂質(zhì)貯積過程中相關(guān)蛋白正常功能和清除錯(cuò)誤蛋白的重要途徑。泛素連接酶通過決定泛素化的時(shí)間性和特異性，間接調(diào)控蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白底物降解，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，影響脂質(zhì)貯積。由于E3連接酶既定了泛素化通路底物的特異性，因此篩選脂質(zhì)貯積相關(guān)E3連接酶，有助于發(fā)現(xiàn)NAFLD中脂質(zhì)代謝異常通路，開發(fā)潛在藥物，具有重大的生物學(xué)意義和臨床效應(yīng)。我們利用實(shí)驗(yàn)平臺(tái)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)，構(gòu)建了包含人類2196個(gè)E3連接酶sgRNA的慢病毒庫(kù)和首個(gè)人E3

5、連接酶敲除細(xì)胞庫(kù)，運(yùn)用BODIPY(@)493/503染料和NAFLD細(xì)胞模型建立了脂質(zhì)熒光報(bào)告系統(tǒng)，通過流式技術(shù)進(jìn)行功能E3連接酶的篩選，發(fā)現(xiàn)了24個(gè)影響NAFLD中脂質(zhì)貯積的E3連接酶。WWP2等10個(gè)E3連接酶具有促脂質(zhì)貯積作用，ING2、UBE2D1等14個(gè)E3連接酶是脂質(zhì)貯積的負(fù)調(diào)控因子。這些E3連接酶的發(fā)現(xiàn)，有助于深入研究泛素-蛋白酶體通路對(duì)NAFLD發(fā)生發(fā)展的作用，開發(fā)特效藥物。
　　上述研究結(jié)果闡述了caveoli