CLC-3調(diào)節(jié)表皮干細(xì)胞遷移修復(fù)皮膚創(chuàng)面作用的研究.pdf

1、目的：
　　當(dāng)創(chuàng)傷發(fā)生時(shí)，如果組織的完整和內(nèi)部平衡重建，體內(nèi)多種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的路徑會(huì)被激活并相互協(xié)調(diào)(1)。研究發(fā)現(xiàn)表皮干細(xì)胞ESCs能夠從表皮或表皮與皮脂腺間毛囊處漏斗管遷移參與表皮修復(fù)(1-5)。然而對(duì)此創(chuàng)面愈合復(fù)雜生理過程的影響因素仍知之甚少。因?yàn)槿狈?duì)控制表皮干細(xì)胞體積和創(chuàng)傷后遷移運(yùn)動(dòng)影響因素的進(jìn)一步研究，這方面的研究知識(shí)很少。
　　有研究報(bào)道在腫瘤發(fā)育和侵襲中，膜離子通道在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和凋亡中起重要作用(6

2、)。電壓門控性鈉離子通道、鉀離子通道、鈣離子通道在乳腺癌(7)、黑色素瘤(8)、纖維肉瘤(9)的腫瘤侵襲和細(xì)胞遷移中起作用。氯離子通道是體內(nèi)最重要的陰離子通道，基于它的門控機(jī)制，氯離子通道可以被分成五個(gè)亞型，其中之一是容積激活性氯離子通道(VACC)(10)。容積激活性氯離子通道(VACC)對(duì)因受滲透性的細(xì)胞腫脹刺激產(chǎn)生的容積激活性氯離子電流變化(ICl,vol）負(fù)有責(zé)任。通過VACC的氯離子和鉀離子外流同鉀離子通道一起導(dǎo)致被稱為調(diào)節(jié)性

3、體積減小(RVD)的細(xì)胞體積變小(11，12)。VACC變化已經(jīng)確定在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移中起重要作用(13，14)。盡管目前對(duì)于主要負(fù)責(zé)提供容積激活性氯離子電流(ICl,vol)的通道蛋白仍然不確定，CLC-3，作為電壓門控性氯離子通道CLC家族中的一員，是重要分子候選蛋白之一(15-17)。CLC-3是激活和調(diào)節(jié)容積激活性氯離子電流(ICl,vol)的分子成分(18，19)。在很多腫瘤細(xì)胞中它的蛋白表達(dá)得到確定，包括前列腺癌上皮細(xì)胞(

4、20)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(21)、PC12細(xì)胞(22)和CNE-2Z細(xì)胞(23)。大量研究重點(diǎn)放在了氯離子通道的表達(dá)及其在細(xì)胞遷移和侵襲中發(fā)揮作用上。問題是表皮干細(xì)胞上是否有CLC-3氯通道蛋白表達(dá)，如果有，CLC-3氯通道蛋白是否通過容積激活性氯離子電流(ICl,vol)或調(diào)節(jié)性體積減小(RVD)來調(diào)節(jié)表皮干細(xì)胞的細(xì)胞體積變化。創(chuàng)面修復(fù)過程中表皮干細(xì)胞遷移時(shí)CLC-3氯通道蛋白作用也沒有在皮膚切除模型中研究過。因此，我們對(duì)表皮干細(xì)胞上C

5、LC-3氯通道蛋白表達(dá)及容積激活性氯離子通道(VACC)功能作用進(jìn)行了研究，使用RNA干擾抑制CLC-3氯通道蛋白表達(dá)來評(píng)估CLC-3氯通道蛋白在表皮干細(xì)胞遷移中的作用。
　　本課題主要就表皮干細(xì)胞遷移的“內(nèi)在動(dòng)力”作為切入點(diǎn)，對(duì)CLC-3氯通道蛋白在表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)中的作用進(jìn)行初步研究。我們對(duì)表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)中CLC-3氯通道蛋白所起調(diào)節(jié)作用的研究，將有助于尋找介入表皮干細(xì)胞遷移的靶點(diǎn)和挖掘有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合治療措施。

6、　　方法：
　　1.在體外培養(yǎng)的正常大鼠表皮干細(xì)胞中提取總RNA，并用RT-PCR方法檢測CLC-3氯通道m(xù)RNA在正常大鼠表皮干細(xì)胞上的表達(dá)。
　　2.Western Blotting方法檢測CLC-3蛋白在正常大鼠表皮干細(xì)胞上的表達(dá)。
　　3.在體外培養(yǎng)的正常大鼠表皮干細(xì)胞上經(jīng)過免疫熒光方法觀察CLC-3氯通道蛋白是否表達(dá)。
　　4.免疫熒光方法檢測正常SD大鼠皮膚表皮干細(xì)胞分布情況及CLC-3氯通道蛋白表達(dá)

7、情況。免疫熒光雙標(biāo)染色觀察正常大鼠急性皮膚傷切除模型創(chuàng)面愈合過程中創(chuàng)緣表皮干細(xì)胞分布情況及CLC-3氯通道蛋白表達(dá)情況。
　　5.CLC-3過表達(dá)及抑制表達(dá)載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞及對(duì)表皮干細(xì)胞CLC-3的影響。
　　6.CLC-3過表達(dá)及抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.在體外培養(yǎng)的正常大鼠表皮干細(xì)胞中提取總RNA，并用RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)CLC-3氯通道m(xù)RNA在

8、正常大鼠表皮干細(xì)胞上表達(dá)。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組無條帶，而表皮干細(xì)胞在電泳結(jié)果上出現(xiàn)一條特異擴(kuò)增條帶，位置為200bp，表明CLC-3氯通道m(xù)RNA在正常大鼠表皮干細(xì)胞上表達(dá)。
　　2.Western Blotting方法檢測發(fā)現(xiàn)CLC-3蛋白在正常大鼠表皮干細(xì)胞上表達(dá)。檢測到一條分子量為92kDa的CLC-3蛋白在正常大鼠表皮干細(xì)胞上的表達(dá)。
　　3.在體外培養(yǎng)的正常大鼠表皮干細(xì)胞經(jīng)過免疫熒光方法觀察發(fā)現(xiàn)CL

9、C-3氯通道蛋白在正常大鼠表皮干細(xì)胞上表達(dá)?？梢钥吹桨?、胞漿有紅色熒光的陽性表達(dá)，表明正常大鼠表皮干細(xì)胞上有CLC-3氯通道蛋白表達(dá)，定位于胞膜、胞漿。
　　4.免疫熒光方法檢測正常SD大鼠皮膚CLC-3氯通道蛋白情況，我們選用一直被研究者公認(rèn)并采用的標(biāo)記物β1整合素作為ESCs的陽性篩選標(biāo)記（綠色熒光），與CLC-3氯通道蛋白共定位，結(jié)果顯示可見表皮基底層細(xì)胞排列規(guī)則，整齊，表皮基底層細(xì)胞體積正常，細(xì)胞漿熒光強(qiáng)度弱，胞膜、胞漿

10、有紅色熒光的陽性表達(dá)。表明正常大鼠皮膚表皮上有CLC-3氯通道蛋白表達(dá)。免疫熒光雙標(biāo)染色觀察正常大鼠急性皮膚傷切除模型創(chuàng)面愈合過程中創(chuàng)緣表皮干細(xì)胞分布情況及CLC-3氯通道蛋白的表達(dá)，標(biāo)記物β1整合素作為ESCs的陽性篩選標(biāo)記（綠色熒光），與CLC-3氯通道蛋白（紅色熒光）共定位，致傷后1天，我們看到創(chuàng)緣部位表皮層沒有出現(xiàn)明顯的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，表皮層沒有增厚，但能夠在創(chuàng)緣附近表皮層中看到有少量膜熒光較強(qiáng)的細(xì)胞。致傷后3天時(shí)，創(chuàng)緣胞膜熒光陽

11、性表達(dá)細(xì)胞明顯增多，創(chuàng)緣表皮層增厚。致傷后7天時(shí)，創(chuàng)緣部位表皮基底層細(xì)胞形態(tài)仍不規(guī)則，依然處于旺盛的增殖分裂狀態(tài)，創(chuàng)緣胞膜熒光陽性表達(dá)細(xì)胞熒光略微減弱，創(chuàng)緣部位表皮層厚，細(xì)胞數(shù)量多。致傷后10天時(shí)，創(chuàng)緣部位表皮基底層細(xì)胞排列逐漸緊密，細(xì)胞形態(tài)變得規(guī)則整齊，創(chuàng)緣胞膜熒光陽性表達(dá)細(xì)胞熒光進(jìn)一步減弱，創(chuàng)緣部位表皮層變薄，細(xì)胞數(shù)量減少。
　　5.CLC-3表達(dá)及抑制表達(dá)載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞及對(duì)表皮干細(xì)胞CLC-3的影響。熒光顯微鏡鏡下

12、觀察表皮干細(xì)胞形態(tài)及感染效率，可以看到感染慢病毒的表皮干細(xì)胞生長狀況良好，形態(tài)正常，RNA干擾靶點(diǎn)病毒感染效率均高于90％。Real-time PCR檢測最優(yōu)靶點(diǎn)mRNA的敲除效率基因表達(dá)變化分析結(jié)果，Western Blot檢測最優(yōu)靶點(diǎn)蛋白水平的敲除效率蛋白表達(dá)變化分析結(jié)果，轉(zhuǎn)染CLCN3表達(dá)病毒后，CLCN3蛋白水平有所上升。CLCN3sh2和CLCN3sh3都能有效降低CLCN3氯通道蛋白表達(dá)水平，而CLCN3sh1和contro

13、l組相比對(duì)CLCN3氯通道蛋白表達(dá)水平影響沒有顯著差異(P＞0.05)，而CLCN3sh2干擾序列能夠最有效的干擾CLCN3基因的轉(zhuǎn)錄。CLCN3sh2干擾序列能夠有效的抑制CLCN3蛋白的表達(dá)。
　　6.CLC-3過表達(dá)及抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流變化情況。我們應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對(duì)表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流變化情況進(jìn)行了檢測，我們對(duì)大鼠表皮干細(xì)胞等滲狀態(tài)下、Lv-CLC3-NC組、Lv-CLC3-over e

14、xpression組、Lv-CLC3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞低滲狀態(tài)下的電壓-電流關(guān)系進(jìn)行了分析，當(dāng)Lv-CLC3-NC組、Lv-CLC3-over expression組、Lv-CLC3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流受低滲外液刺激被激活后，Lv-CLC3-over expression組較Lv-CLC3-NC組、Lv-CLC3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞不同鉗制電壓的電流值更高，波動(dòng)更明顯。而Lv-CLC3-sh組低于Lv-CLC3-

15、NC組大鼠表皮干細(xì)胞不同鉗制電壓的電流值，波動(dòng)不明顯。我們對(duì)膜電位鉗制于+100mV時(shí)的細(xì)胞平均電流密度值進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)膜電位鉗制于+100mV時(shí)，Lv-CLC3-NC組大鼠表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流平均電流密度值為722.77±21.57pA，Lv-CLC3-over expression組大鼠表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流平均電流密度值為1257.39±41.58pA，顯著高于Lv-CLC3-NC組大鼠表皮干細(xì)胞容積敏感性

16、氯電流平均電流密度值為722.77±21.57pA(P＜0.01)。Lv-CLC3-sh組大鼠表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流平均電流密度值為367.43±18.41pA，顯著低于Lv-CLC3-NC組大鼠表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流平均電流密度值為722.77±21.57pA和Lv-CLC3-over expression組大鼠表皮干細(xì)胞容積敏感性氯電流平均電流密度值為1257.39±41.58pA(P＜0.01)。
　　結(jié)論：