FoxN1、GDF11及Exosome在免疫系統(tǒng)老化與抗老化中的作用.pdf

1、目的：
　　免疫系統(tǒng)發(fā)育異常及免疫系統(tǒng)的老化是許多老年相關(guān)性疾病、惡性腫瘤、心血管疾病及神經(jīng)退行性疾病的重要發(fā)病原因。大量的研究表明FoxN1基因表達對免疫系統(tǒng)中的胸腺發(fā)育及T細胞生成具有關(guān)鍵作用。FoxN1主要表達在皮膚以及胸腺的上皮細胞(TECs)，對皮膚以及胸腺的上皮細胞發(fā)育起重要作用。先天的FoxN1基因變異會導(dǎo)致胸腺的上皮細胞(TECs)的發(fā)育障礙，出生后FoxN1基因表達過低導(dǎo)致胸腺萎縮，T淋巴細胞生成能力降低。Fox

2、N1的表達隨著年齡的增大而降低，F(xiàn)oxN1在老年個體中表達極微弱。因此我們通過內(nèi)源性途徑構(gòu)建了FoxN1基因過表達小鼠來研究FoxN1基因過表達能否促進免疫系統(tǒng)的發(fā)育以及能否促進老化萎縮的胸腺再生。另外一些科研團隊在年輕個體的血液中發(fā)現(xiàn)了循環(huán)因子能有效逆轉(zhuǎn)組織老化。在老年小鼠模型中注射年輕的循環(huán)因子能有效改善老年骨骼肌、神經(jīng)系統(tǒng)以及心肌系統(tǒng)的干細胞微環(huán)境，從而提高老化組織的干細胞再生能力使得這些老化的器官系統(tǒng)再生。這些環(huán)境循環(huán)因子可能是

3、生長因子例如GDF11，或者可能是能調(diào)節(jié)基因表達的micro-RNA。因此我們通過外源性途徑注射環(huán)境循環(huán)因子GDF11和Exosome研究其能否有效地逆轉(zhuǎn)老化的免疫系統(tǒng)，并且減輕老年個體的慢性炎癥反應(yīng)，從而有效地發(fā)揮抗老化作用。
　　方法：
　　一、FoxN1基因條件性過表達小鼠構(gòu)建
　　1.利用質(zhì)粒重構(gòu)等基因工程技術(shù)構(gòu)建Rosa26-STOPflox-FoxN1轉(zhuǎn)基因小鼠;
　　2.利用western blot

4、和Southern Blot技術(shù)對構(gòu)建后基因靶條帶進行鑒定;
　　3.利用雜交技術(shù)獲得多種不同的FoxN1條件性過表達轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　二、FoxN1基因過表達對免疫系統(tǒng)的發(fā)育的影響
　　1.采HE染色方法檢測K14CreERT介導(dǎo)的FoxN1基因過表達小鼠的皮膚結(jié)構(gòu);
　　2.采用免疫熒光染色技術(shù)分析FoxN1TguCreERT小鼠的胸腺結(jié)構(gòu)，并通過細胞流式分析確定FoxN1TguCreERT小鼠胸腺皮質(zhì)/髓質(zhì)

5、的比例;
　　3.采用細胞流式染色分析胸腺T細胞各亞群的發(fā)育以及外周T細胞的功能活性;
　　4.采用Realtime-PCR分析FoxN1Tg在骨髓異位表達情況，并通過細胞流式分析FoxN1Tg在骨髓異位表達對骨髓及脾臟B細胞發(fā)育的影響;
　　三、外源性途徑注射環(huán)境循環(huán)因子GDF11和Exosome后能否有效地逆轉(zhuǎn)老化的免疫系統(tǒng)
　　1.通過對老年小鼠腹腔注射GDF11和Exosome，采用流式細胞術(shù)分析GDF1

6、1和Exosome對外周T細胞功能的影響;
　　2.采用Elisa分析外周血中炎癥反應(yīng)情況;
　　3.采用流式細胞術(shù)分析外周脾臟中炎癥反應(yīng)情況;
　　4.采用Realtime-PCR分析胸腺中的炎癥反應(yīng)情況。
　　結(jié)果：
　　一、通過內(nèi)源性途徑構(gòu)建FoxN1基因過表達小鼠
　　1.利用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了Rosa26-STOPflox-FoxN1轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　2.將Rosa26-STOPf

7、lox-FoxN1轉(zhuǎn)基因小鼠與uCreERT、K14CreERT以及K5CreERT小鼠雜交，獲得三種不同的FoxN1基因過表達小鼠。
　　二、FoxN1基因過表達能否促進免疫系統(tǒng)的發(fā)育以及能否促進老化萎縮的胸腺再生
　　1.K14Cre+介導(dǎo)的新生FoxN1過表達小鼠存在皮膚滲透性增加以及喂養(yǎng)方面缺陷導(dǎo)致其出生后24小時內(nèi)死亡;
　　2.uCreERT介導(dǎo)的FoxN1過表達對幼年期胸腺發(fā)育成熟有不利的影響，并且導(dǎo)致外

8、周T淋巴細胞功能退化;
　　3.幼年小鼠通過uCreERT調(diào)節(jié)外源FoxN1Tg在骨髓異位表達，影響B(tài)細胞的發(fā)育;
　　4.K5CreERT介導(dǎo)FoxN1過表達影響幼年小鼠胸腺和皮膚的發(fā)育，但對成年小鼠無不良影響;
　　三、外源性途徑注射環(huán)境循環(huán)因子GDF11和Exosome后能否有效地逆轉(zhuǎn)老化的免疫系統(tǒng)
　　1.年輕系統(tǒng)性環(huán)境循環(huán)因子GDF11和Exosome能逆轉(zhuǎn)老化的T細胞免疫系統(tǒng)，促使老化萎縮的胸腺增大，

9、T細胞生成能力提高，外周T細胞活性增強;
　　2.年輕系統(tǒng)性環(huán)境循環(huán)因子GDF11和Exosome能減輕老年個體存在的慢性炎癥反應(yīng);
　　3.老年小鼠Exosome注射后胸腺內(nèi)GDF11表達升高，提示Exosome可能是GDF11的上游調(diào)節(jié)因子，通過促進GDF11表達而發(fā)揮抗老化作用。
　　結(jié)論：
　　1.早期異位表達及大量過表達FoxN1基因會影響胸腺上皮細胞、T細胞、B細胞以及皮膚上皮細胞的發(fā)育，損害了免疫系