鐵蛋白納米籠為載體的多模式成像及靶向治療的研究.pdf

1、臨床上單獨使用化療的方法，常常會導致腫瘤的治療效果不佳，提出將診斷與治療相結合的方法，探索診療一體化的治療方案是提高腫瘤治療的有效手段之一。由于鐵蛋白具有高度的均勻性、可控的組裝性、還有易于修改和大量的制備，它受到了納米生物學領域科學家們越來越多的關注。本研究將鐵蛋白去除鐵核后，將藥物Doxorubicin包裹在AFn籠內，表面修飾Fe3O4和Cdots后使其具有磁靶向能力和熒光標記能力，通過周圍環(huán)境pH的變化控制藥物釋放。其主要內容包

2、括：（1）構建診療一體化的多功能鐵蛋白藥物轉運系統(tǒng)；（2）采用人源乳腺癌細胞（MCF-7）為模型，評價其體外抗腫瘤活性；（3）采用鼠源黑色素瘤B16-F10細胞株，建立C57雌性小鼠荷瘤模型對其體內抗腫瘤活性進行評價。
　　為得到AFn/DOX復合物，首先將鐵蛋白去除鐵核后得到中空籠狀結構的去鐵蛋白，然后利用鐵蛋白自組裝的性質，使藥物小分子（DOX）包載在去鐵蛋白籠內。為使納米載體具有熒光探針性質，實現(xiàn)腫瘤診斷功能，本研究通過酰胺

3、鍵將Cdots連接到AFn/DOX復合物表面；為實現(xiàn)磁靶向和核磁成像功能，本研究將AFn/DOX-Cdots中間產(chǎn)物連接到四氧化三鐵納米粒子的表面，構建出了一種多功能的Fe3O4-AFn/DOX-Cdots納米轉運藥物載體，該多功能納米轉運藥物載體具有磁靶向能力和核磁成像能力，使腫瘤細胞對藥物有更高的攝取量，提高了腫瘤治療指數(shù)；同時又可以實現(xiàn)熒光標記，實時監(jiān)測腫瘤位置的動態(tài)變化，實現(xiàn)腫瘤在熒光方向的診斷。
　　Fe3O4-AFn/

4、DOX-Cdots納米載藥體系的制備主要采用攪拌的方法，在EDC和NHS的催化作用下，羧基與氨基反應形成酰胺鍵，并優(yōu)化處方。將制備得到的Fe3O4-AFn/DOX-Cdots納米復合物分別用紫外可見分光光度計、紅外分光光度計和熒光分光光度計進行了表征；采用Nano-zs90型激光納米粒度分布儀檢測，結果顯示，去鐵蛋白的平均粒徑約為12±2.0nm，PDI為0.2左右，Cdots水溶液粒度分布均勻，平均粒徑約為5±2.0nm，PDI為0.

5、2左右；采用熒光分光光度計對不同pH值的Cdots水溶液熒光強度進行了考察，結果顯示，pH=4.0時Cdots水溶液具有最大的熒光強度；透射電鏡（TEM）結果顯示，F(xiàn)e3O4-AFn/DOX-Cdots為類球形；采用紫外可見分光光度計檢測藥物的吸光度，測定載藥系統(tǒng)中 DOX的載藥量，結果表明，DOX在納米復合物中的載藥量達6.3％；在37℃條件下，采用透析袋法分別測定了Fe3O4-AFn/DOX-Cdots在pH=5.0和pH=7.4時

6、DOX的體外釋放，結果表明酸性條件更適合該體系釋放藥物，通過調節(jié)酸堿度能較好的控制藥物釋放；Fe3O4-AFn/DOX-Cdots具有強磁性，MRI實驗表明Fe3O4-AFn/DOX-Cdots在磁共振T2場成像，具有明顯的濃度依賴性和黑化效應。
　　本研究選擇人源的乳腺癌細胞（MCF-7）作為其體外抗腫瘤活性評價的模型，采用MTT法考察了Fe3O4-AFn-Cdots空白載體的細胞毒性及對乳腺癌細胞的影響，結果顯示，空白載體對細

7、胞幾乎沒有毒性作用，可以認為載體是無毒的；同時又考察了 Fe3O4-AFn/DOX-Cdots的細胞毒性及其濃度、作用時間與磁場對乳腺癌細胞的影響，結果顯示，在72h時，當 DOX濃度為50μg/ml的抑制率最大，顯著增強了細胞得抑制率，明顯增強細胞的毒性；與Fe3O4-AFn/DOX-Cdots不加磁組相比，F(xiàn)e3O4-AFn/DOX-Cdots/magnet組有更多的細胞攝入量，表明Fe3O4的磁靶向特性更有利于包裹的藥物進入細胞內

8、部；在MCF-7攝取實驗中，通過細胞內攝取實驗初步研究了其細胞毒作用機制，并采用空白載體考察Cdots連接到載體后的細胞成像情況，F(xiàn)e3O4-AFn-Cdots納米復合物進入到MCF-7細胞內，經(jīng)過24h后，明顯呈現(xiàn)出大量藍色點狀熒光。
　　采用鼠源黑色素瘤B16-F10細胞株，建立C57雌性小黑鼠荷瘤作為其體內抗腫瘤活性評價的模型。Fe3O4-AFn/DOX-Cdots的體內抗腫瘤效果評價中，考察了 Fe3O4-AFn/DOX-

9、Cdots納米載藥體系對荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用，結果表明Fe3O4-AFn/DOX-Cdots在磁靶向的載藥系統(tǒng)作用下藥物更易于滯留在腫瘤部位，在腫瘤部位的酸性環(huán)境下，藥物更易從鐵蛋白籠內釋放出來，實現(xiàn)殺傷腫瘤細胞的效果。DOX在小鼠血漿的藥代動力學實驗結果表明，F(xiàn)e3O4-AFn/DOX-Cdots明顯延長了 DOX在血液中的循環(huán)停留時間。此外，MRI結果顯示注射Fe3O4-AFn/DOX-Cdots后，在外加磁場作用下，小鼠腫瘤部位

10、觀察到明顯的黑化現(xiàn)象，說明Fe3O4-AFn/DOX-Cdots可作為體內核磁成像T2場的造影劑。
　　體外抗腫瘤活性實驗表明：Fe3O4-AFn/DOX-Cdots可以有效的靶向 MCF-7細胞，并高效的穿透細胞膜，攜帶更多的DOX進入細胞內部，腫瘤酸性環(huán)境使鐵蛋白籠打開，釋放出藥物，從而誘導MCF-7細胞凋亡，最終抑制MCF-7細胞的生長和增殖。體內的抗腫瘤活性實驗表明：Fe3O4-AFn/DOX-Cdots具有較低的系統(tǒng)毒性