柔嫩艾美耳球蟲肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白解聚因子基因的克隆表達(dá)和功能初步的研究.pdf

1、雞球蟲為孢子蟲綱、真球蟲目、艾美耳科、艾美耳屬的一類，是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，每年都造成養(yǎng)雞業(yè)巨大經(jīng)濟(jì)損失。其中柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)是主要的雞球蟲之一，寄生于雞盲腸內(nèi)，引起雞血便，死亡和飼料利用率降低。E. tenella和其它頂復(fù)門寄生蟲一樣能依賴于肌動(dòng)蛋白骨架有效而且快速地入侵宿主細(xì)胞。肌動(dòng)蛋白骨架包括肌動(dòng)蛋白(actin)家族和肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白(actin related proteins，ARPS)家族

2、。肌動(dòng)蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor，ADF)是肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白的一類，廣泛存于真核細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白，通過切斷肌動(dòng)蛋白纖絲和增加肌動(dòng)蛋白纖絲解聚作用來重塑細(xì)胞骨架，進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、凋亡及胚胎發(fā)育等重要生理功能。本研究以：Etactin和ADF為對(duì)象，在國(guó)內(nèi)外首次初步探討其在球蟲細(xì)胞入侵中的作用，主要研究成果如下： 1.E. tenella ADF基因的克隆和表達(dá)通過PCR首次

3、克隆獲得了EtADF基因，其ORF序列長(zhǎng)354bp，編碼118個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為13.14kDa；表達(dá)融合蛋白分子量為33.14kDa；純化得到了可溶性ADF，并且獲得了抗體滴度為1：5120的兔抗ADF多克隆抗體。克隆獲得了E. tenella和E necatrix ADF基因組序列，比較兩種序列發(fā)現(xiàn)，EtADF基因組和EnecatrixADF基因組相似性為92.5％，差異主要位于內(nèi)含子部位，而編碼區(qū)僅有4個(gè)核甘酸不同。通過DNA

4、star軟件包中的Megalign程序計(jì)算序列相似性，結(jié)果表明EtADF和T．godnii ADF相似性最高為69.1％，而與其它物種的ADF序列相似性都低于36.4％。進(jìn)化分析結(jié)果表明EtADF和T．gondii ADF位于進(jìn)化樹同一分支上。在結(jié)構(gòu)上EtADF具有與其它真核生物相似高度保守的a螺旋和β折疊構(gòu)構(gòu)象；與酵母cofilin比較，EtADF具有actin單體結(jié)合的位點(diǎn)，但是缺失與actin纖絲結(jié)合的a螺旋序列。EtADF沒有信

5、號(hào)肽序列，沒有核定位信號(hào)序列，有Ser3磷酸化位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)表明EtADF能夠結(jié)合Etactin單體。 2.EtADF表達(dá)動(dòng)態(tài)、EtADF和actin細(xì)胞定位分析在mRNA和蛋白水平研究了EtADF和Etactin在E. tenella不同生活階段的表達(dá)動(dòng)態(tài)。首先通過RT-PCR和Southern blot證實(shí)了EtADF和Etactin mRNA在球蟲子孢子、裂殖子、未孢子化卵囊和孢子化卵囊都有所表達(dá)。Northern blot證明了在球

6、蟲子孢子、裂殖子、未孢子化的卵囊和孢子化的卵囊中只存在一種EtADF和Etactin mRNA．剪切形式。然后用real-time q-PCR檢測(cè)艾美耳球蟲不同生活階段ADF tuRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示ADF mRNA在未孢子化和孢子化卵囊中表達(dá)量均顯著低于在子孢子和裂殖子中的表達(dá)量。Dot Blot實(shí)驗(yàn)表明，Etactin在E. tenella不同生活階段蛋白質(zhì)表達(dá)水平相似；而未孢子化卵囊和孢子化卵囊中ADF蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著低于子孢子

7、和裂殖子中ADF蛋白質(zhì)表達(dá)量。這些結(jié)果表明E. tenella不同生活階段ADF表達(dá)可能是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)。熒光定位發(fā)現(xiàn)，EtADF和Etactin分布于整個(gè)子孢子細(xì)胞內(nèi)，但是它們主要位于子孢子細(xì)胞膜附近。細(xì)胞松弛素B能夠改變子孢子Etactin分布情況，使其均勻分布于細(xì)胞內(nèi)。 3.Etaetin基因的克隆和表達(dá)通過PCR首次克隆獲得了E. tenella的actin基因，其ORF大小為1128bp，編碼376個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子

8、量為42.7kDa：表達(dá)融合蛋白分子量為62.7 kDa；純化得到了可溶性actin，并且獲得了抗體滴度為1：5120小鼠抗actin多克隆抗體。通過DNAstar軟件包中的Megalign程序計(jì)算序列相似性，結(jié)果表明Etactin和T．godnii actin的相似性最高，達(dá)到95.7％，Etactin和其它序列的相似性都大于83.0％。使用Phylip3.67對(duì)寄生蟲actin氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析，其結(jié)果表明Etactin和T．g

9、ondii actin位于進(jìn)化樹同一分支上?？臻g結(jié)構(gòu)模擬表明Etactin的三維結(jié)構(gòu)可分為外部結(jié)構(gòu)域和內(nèi)部結(jié)構(gòu)域，又可以細(xì)分為4個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(亞結(jié)構(gòu)域1-4)，與ADF結(jié)合的位點(diǎn)主要位于亞結(jié)構(gòu)域1和3上。Etactin具有和ATP/ADP結(jié)合位點(diǎn)；亞結(jié)構(gòu)域2中存在一個(gè)DNase Ⅰ結(jié)合環(huán)。 　　4.雞腎細(xì)胞培養(yǎng)和球蟲子孢子入侵雞腎細(xì)胞研究分析以培養(yǎng)雞腎原代細(xì)胞為模型研究Etactin和EtADF在宿主細(xì)胞入侵中功能機(jī)制。以抗子孢子裂解抗

10、原，抗重組EtADF和Etactin的多克隆抗體與子孢子同時(shí)加入細(xì)胞培養(yǎng)也液中共同培養(yǎng)，結(jié)果表明，兔抗子孢子裂解抗原的多克隆抗體能夠阻斷E. tenella子孢子入侵細(xì)胞；而小鼠抗actin多克隆抗體和兔抗ADF多克隆抗體完全不能阻斷Etenella子孢子入侵細(xì)胞。不同劑量的細(xì)胞松弛素B和LY294002在體外都能顯著抑制E.tenella子孢子入侵雞腎細(xì)胞，而lavendustin C在高劑量時(shí)才能顯著抑制子孢子入侵雞腎細(xì)胞；ML-7